T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
T 세포 수용체 절제 원 (TRECs) 및 K-삭제 재조합 절제 원 (KRECs)는 게놈 DNA 재조합 과정 T- 각각 B-세포의 비율로 절제되어 작은 원형으로 DNA 요소이다 선도 매우 다양한 레퍼토리의 T- 및 B- 세포 수용체의 형성. 이들은 어떤 기능이 없지만, 그들이 안정되고 복제 될 수 없기 때문에, 따라서 그들은 단지 두 개의 딸 세포 중 하나로 지속 각 세포 분열 후에 희석된다. 따라서, 말초 혈액에서의 수준은 흉선 및 골수의 출력 추정값으로서 가정 될 수있다.
TREC 분석은 주로 흉선 출력의 정도를 평가하기 위해 지난 15 년 동안 사용되었지만, 초기에 개발 된 1 KREC 분석은 B 세포의 증식 및 건강과 질환에서의 B 세포의 항상성에 기여 2 측정 최근 골 m의 마커로서 제안되었다출력 화살표. 3,4 여기, 우리는 우리가 TRECs과 KRECs 모두의 동시 정량을 위해 개발 된 방법을 설명합니다. (4)
이 조합 된 방법으로, 실시간 PCR에 의해 DNA 정량 연관된 가변성 TRECs, KRECs 및 T 세포 수용체 알파 상수의 단편을 함유하는 트리플 삽입 플라스미드를 희석 한 고유의 표준 곡선을 사용 (TCRAC)에 의해 제거된다 1 : 1 : 1 비율의 유전자. 이것은 TREC와 KREC 카피 수의 더 정확한 평가를 할 수있다. 또한, 동일한 반응에서 두 타겟의 동시 정량 시약 비용 감소를 허용한다.
제안 된 TREC / KREC 분석은 중증 복합 면역 결핍 (SCID), 4 공통 변수 면역 결핍, 5자가 면역 질환, 6-8과 HIV 감염 어린이 또는 성인의 T-의 범위와 B 세포 신 생산을 측정하기 위해 유용 할 수 있습니다 . (9) 또한,이 사용 가능환자 KREC 정량화를 사용하여 식별 될 수 agammaglobulinemia SCID 환자 근본적인 유전 적 결함에도 불구 TREC 분석법을 인식하고 있기 때문에, 최종적. 6-8, 조혈 줄기 세포 이식, 10 효소 대체 (11)와 바이러스 9 또는 면역 요법 후에 면역 회수를 모니터링하고, , TREC / KREC 분석은 또한 신생아 스크리닝 프로그램에서 immunodeficiencies를 검출하는데 사용될 수있다. (12)이 경우, 시험 혈액 도말의 작은 반점에서 추출한 DNA에 대해 수행하고 여과지상에서 건조되어야 고도로 민감하고 특이이어야 표적 질환뿐만 아니라 재현성이 높은 비용 효율적인.
위스콘신부터 소개하는 첫번째되었을 때 시험에 KREC 정량의 도입은 일상적으로 2008 미국 (WI, MA, CA)의 일부 지역에서 수행 된 immunodeficiencies에 대한 신생아 선별 검사의 성능을 개선한다그 산후 검진 프로그램에 TRECs의 전자 분석. (13)
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
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