La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
Círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión recombinación K-borrar (KRECs) son pequeños elementos de ADN circularized que son extirpados en una proporción de las células B, respectivamente, T y durante un proceso de recombinación de ADN genómico, lo que lleva a la formación de un repertorio altamente diversificada de T y receptores de células B. No tienen ninguna función, sino porque son estables y no se pueden replicar, se diluyen después de cada división celular, que persiste por tanto, sólo en una de las dos células hijas. Por lo tanto, sus niveles en la sangre periférica se puede asumir como una estimación de la salida de la médula tímica y el hueso.
Si bien el ensayo TREC se ha utilizado ampliamente en los últimos 15 años para evaluar la magnitud de la producción del timo, 1 ensayo FREC, que fue desarrollado inicialmente para medir la proliferación de células B y su contribución a la homeostasis de las células B en la salud y la enfermedad, 2 sólo recientemente ha sido propuesto como un marcador de hueso mflecha de salida. 3,4 A continuación, describimos el método que hemos desarrollado para la cuantificación simultánea de ambos TRECs y KRECs. 4
Con este método combinado, la variabilidad asociada a la cuantificación de ADN por PCR en tiempo real se elimina mediante el uso de una curva estándar único obtenido por dilución de un plásmido de triple inserto que contiene fragmentos de TRECs, KRECs y de las células T del receptor alfa constante (TCRAC) gen en una proporción de 1: 1: 1. Esto permite una evaluación más precisa del número de copias TREC y FREC. Además, la cuantificación simultánea de los dos objetivos en la misma reacción permite la reducción de costes de reactivos.
El ensayo TREC / FREC propuesto puede ser útil para medir el grado de células T y B neo-producción en niños o adultos con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), 4 Inmunodeficiencia Común Variable, 5 enfermedades autoinmunes, 6-8 y la infección por VIH . 9 Además, se puede utilizar paracontrolar la recuperación inmune después del trasplante de células madre hematopoyéticas, 10 de reemplazo enzimático, 11 y 9 antiviral o inmunomoduladores terapias. 6-8 Finalmente, porque los pacientes SCID se reconocen usando el ensayo de TREC a pesar de los defectos genéticos subyacentes, y agammaglobulinemia pacientes pueden identificarse utilizando la cuantificación FREC , el ensayo TREC / FREC puede también ser utilizado para detectar inmunodeficiencias en programas de cribado neonatal. 12 En este caso, la prueba debe ser realizada en ADN extraído de pequeñas manchas de sangre borrado y se seca sobre papel de filtro, debe ser altamente sensible y específica para las enfermedades objeto, así como altamente reproducible y rentable.
La introducción de FREC cuantificación en la prueba debería mejorar el rendimiento de cribado neonatal para inmunodeficiencias, que habitualmente se ha realizado en las algunas partes de los EE.UU. (WI, MA, CA) desde 2008, cuando se convirtió en Wisconsin el primero en Introde el análisis de TRECs en su programa de detección postnatal. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
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