T-hücre reseptörleri Eksizyon Circles Eşzamanlı Niceleme (TREC) ve K-silme Rekombinasyon Eksizyon Circles (KRECs) Gerçek zamanlı PCR ile
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
T-hücresi reseptör eksizyon daire (TREC) ve K-silme rekombinasyon eksizyon daire (KRECs), genomik bir DNA yeniden birleştirme işlemi sırasında T ve sırasıyla A, B-hücreleri, bir oranda kesilmiş küçük daireselleşmiş DNA elemanları vardır giden Bir çok çeşitlendirilmiş T- repertuarına ve B-hücre reseptörleri oluşumu. Onlar hiçbir işlevi var, ama onlar kararlı ve taklit edilemeyen, çünkü onlar, böylece sadece iki kızı hücrelerin birinde ısrar, her hücre bölünmesinde sonra sulandırılır. Bu nedenle, periferik kandaki düzeylerinin timus, kemik iliği çıkışı bir tahmini olarak kabul edilebilir.
TREC tahlil ölçüde timik çıktı kapsamını değerlendirmek için son 15 yılda kullanılmış olsa da, başlangıçta geliştirilen 1 Krec deneyi, B-hücresi çoğalmasını ve sağlık ve hastalık B-hücresi homeostasisin katkılarını, 2 ölçmek için ancak son zamanlarda kemik m marker olarak önerilmiştirçıktı ok. 3,4 Burada, biz TREC ve KRECs hem eşzamanlı ölçümü için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. 4
Bu kombine yöntem ile, gerçek zamanlı PCR ile DNA miktar ile ilişkili değişkenlik TREC, KRECs ve T-hücresi reseptörü alfa sabit fragmanlarını ihtiva eden bir üç-uç plazmid seyreltilmesi ile elde edilen eşsiz bir standart eğri kullanımı (TCRAC) ile ortadan kaldırılır 1: 1 oranında bir 1 geni. Bu TREC ve Krec kopya sayısında daha doğru bir değerlendirme sağlar. Ayrıca, aynı reaksiyonda iki hedef aynı anda miktar reaktif maliyet azalmasını sağlar.
Önerilen TREC / Krec tahlil Şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID), 4 Ortak Değişken İmmün Yetmezlik, 5 otoimmün hastalıklar, 6-8 ve HIV enfeksiyonu olan çocuklarda veya yetişkinlerde T- kapsamını ve B-hücresi neo-üretim ölçmek için yararlı olabilir . 9 Ayrıca, için kullanılabilirHastalar Krec kantifikasyonunu kullanılarak tespit edilebilir agamaglobülinemı SCID hastalarda altta yatan genetik bozukluklara rağmen TREC testi kullanılarak tanınan, çünkü Sonunda. 6-8 hematopoetik kök hücre nakli, 10 enzim replasmanı, 11 ve antiviral 9 veya bağışıklık tedaviler sonrasında bağışıklık ayilmanizi, ve , TREC / Krec deneyi de doğan tarama programlarına immün yetersizlikler tespit etmek için de kullanılabilir. Bu durumda, 12, test kan lekelenir küçük noktalar ekstre DNA üzerinde yapıldığında ve filtre kağıdı üzerinde kurutuldu gerekir, son derece hassas ve spesifik olmalıdır Hedef hastalıklar yanı sıra, oldukça üretilebilir ve maliyet-etkin bir.
Wisconsin introduc ilk olunca test Krec miktar giriş rutin 2008 yılından bu yana ABD (WI, MA, CA) bazı bölgelerinde yapılmıştır immün için yenidoğan tarama, performanslarını artırmak gerekironun doğum tarama programında TREC e analizi. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
