בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית
Summary
Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.
Abstract
In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.
Introduction
היכולת של משטחים מורכבים-PEG להציג הליגנדים ביוכימיים קוולנטית כרוכים בו-זמנית, תוך שמירה על מאפייני עכירות שאינן טבועים להפוך אותם בחירה אידיאלית עבור סביבות מיקרוסקופיות מותאמות אישית הנדסה על מצעי תרבות 1,2,3. אינטראקציות biospecific מתווכות על ידי מברשות PEG יגנד מצומדות מאפשרת ניתוח מצמצם של ההשפעות של יוכימיים רמזים שנמצאו בתוך מתחם במייקרו-סביבות רקמות vivo על פנוטיפים תא בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש chemistries "לחץ" ביו-מאונך כדי להקל על חוסר תנועה כיוונית של הליגנדים, כך שהם מוצגים בתצורות ילידי 4-6. כך, דפוסים מרחביים מיקרוסקופים של PEG מברשות הוא כלי תכליתי ליצירת מעצב בנישות מבחנה לחקור איתות תא הנגרמת על ידי רמזים ביוכימיים משותקים 6,7.
שיטה נפוצה ליצירת תבניות המרחביות של מ"ק ביוכימייםes כרוך מצעים מצופים זהב הדפסת microcontact (μCP) עם דפוסי alkanethiols מצומדות PEG. ואז, monolayers micropatterned העצמי התאספו (טילי הקרקע-האוויר) של alkanethiols ylated-PEG מגביל ספיחה פיזית של מולקולות ביוכימיות, למשל, חלבונים, רק לאזורים בדוגמת שאינה של המצע 8,9. עם זאת, טילי הקרקע-האוויר שנוצרו על ידי טכניקה זו הן רגישות לחמצון בתרבית תאי תקשורת לטווח ארוך. כך, μCP'd alkanethiol טילי הקרקע-האוויר לעתים קרובות מורכב עוד יותר עם מברשות פולימר PEG באמצעות פילמור הרדיקלי העברת אטום ביוזמת פני השטח (SI-ATRP) כדי להגביר את היציבות שאינה מזהמת את האזור 10. באופן ספציפי, μCP של יוזם פילמור alkanethiol, bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl, על משטחים מצופים זהב ואחריו SI-ATRP של פולי (אתילן גליקול) methacrylate אתר מתיל (PEGMEMA) מונומרים יוצר משטחים עם טווח ארוך micropatterned, יציב, ושאינה עכירות PEG מברשות. יתר על כן, אלה הם מסוגלים להיות שונה יותר להציג moieties הכימית מגוון 11.
ניצול של נכס זה, שא et. אל. פיתח שיטה להנדס מצעי תרבות עם מברשות PEGMEMA multicomponent הצגת chemistries "לחץ" מאונך. בשיטה זו, הם משתמשים בסדרה של צעדי μCP / SI-ATRP ביניהם אזיד הנתרן רציף, ethanolamine, וpropargylamine החלפות nucleophilic ליצור מצעי תרבות מציגים דפוסים מיקרוסקופים של הליגנדים משותקים מרובים 6. בעוד שהפוטנציאל של שימוש chemistries כזה בשיתוף עם μCP מדריך ללהנדס מצעי תרבות רומן הוא עצום, הוא מוגבל על ידי הדיוק ואת הדיוק שבה ניתן ליישר צעדי μCP מרובים על מצע אחד. רמה גבוהה של דיוק ודיוק היה נדרשת לייצור reproducibly מורכב בנישות מבחנה תוך שימוש בטכניקות מגוונות אלה.
e_content "> כדי לטפל במגבלה זו, מספר מערכות μCP אוטומטית וחצי אוטומטי שנוצרו. צ'אקרה et. al. פיתחו מערכת μCP בי בולים מותאמים אישית מונחים על מערכת רכבות והביאו במגע קונפורמי עם מגלשות מצופים זהב באמצעות מפעיל פנאומטי מבוקרת מחשב. עם זאת, שיטה זו דורשת ייצור המדויק של עיצובי בולים מותאמים אישית ומדווח 10 מיקרומטר דיוק ללא דו"ח של הדיוק שהושג בעת ביצוע μCP מרובה השלבים 12. לאחרונה, שיטת ניצול מערכת צימוד kinematic משולבת דיוק שדווח להלן 1 מיקרומטר באמצעות דפוס בודד, אבל לא הצליחו ליישר במדויק דפוסים מרובים בשל חוסר השליטה מדויקת של תכונות חותמת מעובש לעצב 13. בנוסף, בשתי השיטות הקודמות דורשים מצע ליישארו קבועים בין צעדי דפוסים , וכך להגביל את מגוון chemistries שינוי פני השטח שיכול להיות משמעותימנוצל. כאן, אנו מתארים מערכת R-μCP אוטומטית מסוגל יישור מדויק ומדויק של צעדי μCP מרובים תוך מתן גמישות מירבית בעיצוב בולים וייצור. יתר על כן, מצעים בדוגמת ניתן להסיר שוב ושוב מהמערכת בין stampings, ובכך לאפשר את שימוש בchemistries שינוי המצע מגוון, כוללים החלפות nucleophilic רציפות. מצעים שהונדסו בשיטות chemistries כזה כבר נעשו שימוש בתרבית תאים בעבר על ידי שנינו 6,14 ואחרים 7. כך, יש לנו התמזגו R-μCP ותגובות התמר נוקלאופילית רציפות לפתח שיטה לייצור להרחבה של מצעי תרבות עם רמזים ביוכימיים מורכבים וmicropatterned.Protocol
Representative Results
Discussion
מצעים אידיאליים עבור הנדסת רקמות יהיו bioinspired ובכך לשחזר את ההתפלגות המרחבית של ביו הליגנדים קריטיים נמצאים בתוך הרקמות המקומיות. הם גם היו בעלי תכונות דינמיות המאפשרות התאמות זמניות של הליגנדים ודפוסי המרחב שבו הם מוצגים כדי לאפשר המורפוגנזה רקמה ביימה ומרחבית מוג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 mL | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2',2-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit – NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
