افتعال ركائز الثقافة معقدة باستخدام الروبوتية Microcontact الطباعة (R-μCP) وتبديل أليف النواة متسلسل
Summary
Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.
Abstract
In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.
Introduction
قدرة السطوح PEG المطعمة لعرضه بروابط كيميائية حيوية مرتبطة تساهميا مع الحفاظ في نفس الوقت المتأصلة خصائص غير قاذورات تجعلها خيارا مثاليا لبيئات الميكروسكيل الهندسة الجمركية على ركائز الثقافة 1،2،3. التفاعلات biospecific بوساطة يجند مترافق فرش PEG تتيح تحليل reductionistic من آثار الاشارات البيوكيميائية وجدت داخل المجمع في microenvironments أنسجة الجسم الحي على الظواهر الخلايا الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كيمياء الحيوية متعامد "فوق" لتسهيل تجميد الاتجاه من بروابط بحيث يتم تقديمها في التشكل الأصلي 4-6. وبالتالي، الزخرفة المكانية الميكروسكيل من PEG فرش هو أداة مرنة لخلق مصمم في محاريب المختبر للتحقيق إشارات الخلايا الناجم عن الإشارات البيوكيميائية يجمد 6،7.
وهناك طريقة شائعة لتوليد الأنماط المكانية للمكعب الكيمياء الحيويةوفاق ينطوي microcontact الطباعة (μCP) ركائز المغلفة بالذهب مع أنماط PEG alkanethiols مترافق. ثم، والطبقات الوحيدة الذاتي تجميعها micropatterned (سام) من alkanethiols PEG-ylated تقيد امتصاص المادي للجزيئات الحيوية، مثل البروتينات، إلا أن المناطق غير نمط الركيزة 8،9. ومع ذلك، فإن صواريخ سام التي تولدها هذه التقنية حساسة للأكسدة في المدى الطويل وسائل الإعلام ثقافة الخلية. وبالتالي، μCP'd alkanethiol سام غالبا ما المطعمة كذلك مع فرش PEG البوليمر باستخدام بمبادرة سطح نقل ذرة البلمرة الراديكالية (SI-ATRP) إلى زيادة غير قاذورات الاستقرار في المنطقة 10. على وجه التحديد، μCP من البلمرة البادئ alkanethiol، bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl، على الأسطح المغلفة الذهب تليها SI-ATRP من بولي (جلايكول الإثيلين) ميتاكريليت الميثيل الأثير (PEGMEMA) أحادية يولد الأسطح مع micropatterned طويلة الأجل ومستقرة، وغير فرش قاذورات PEG. وعلاوة على ذلك، فإن هذه هي قابلة للتعديل أيضا على تقديم الأنصاف الكيميائية المتنوعة 11.
الاستفادة من هذه الخاصية، شا آخرون. الله. وضعت طريقة لهندسة ركائز الثقافة مع فرش PEGMEMA المتعددة المكونات تقديم المتعامدة كيمياء "فوق". في هذه الطريقة، فإنها تستخدم سلسلة من الخطوات μCP / SI-ATRP تتخللها أزيد الصوديوم متتابعة، ايثانول، وpropargylamine بدائل أليفة النواة لخلق ركائز ثقافة تقديم أنماط الميكروسكيل من بروابط متعددة يجمد 6. في حين أن احتمال استخدام تلك كيمياء بالتزامن مع μCP اليدوي لهندسة ركائز ثقافة جديدة هائلة، ويقتصر من قبل على الدقة والدقة التي μCP خطوات متعددة يمكن محاذاة على ركيزة واحدة. سوف تكون هناك حاجة لمستوى عال من الدقة والدقة لتصنيع بتكاثر مجمع في محاريب المختبر باستخدام هذه التقنيات تنوعا.
e_content "> ولمعالجة هذا الحد، فقد تم إنشاء العديد من أنظمة μCP الآلية وشبه الآلية. شقرا وآخرون وضع نظام μCP التي توضع الأختام الجمركية على نظام السكك الحديدية وأدى إلى امتثالي اتصال مع الشرائح المغلفة الذهب باستخدام والمحرك الكمبيوتر التي تسيطر عليها الهوائية. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تصنيع الدقيق للتصاميم طابع العرف وتقارير 10 ميكرومتر الدقة مع أي تقرير من دقة تحقيقها عند تنفيذ العديد من الخطوات μCP 12. وفي الآونة الأخيرة، وهي طريقة استخدام نظام اقتران الحركية متكامل ذكرت الدقة أقل من 1 ميكرون باستخدام نمط واحد، ولكن لم تتمكن من محاذاة بدقة أنماط متعددة نظرا لعدم وجود مراقبة دقيقة من الميزات ختم من العفن العفن 13. بالإضافة إلى ذلك، كل من الطرق السابقة تتطلب الركيزة لتظل ثابتة بين الخطوات الزخرفة ، مما يحد بشكل كبير من التنوع في كيمياء تعديل السطح التي يمكن أن تكونالمستخدمة. هنا، نحن تصف نظام R-μCP الآلي قادرة على محاذاة دقيقة ودقيقة من الخطوات μCP متعددة مع السماح بالمرونة القصوى في تصميم الطوابع وتلفيق. وعلاوة على ذلك، فإن ركائز نمط يمكن إزالة مرارا وتكرارا من النظام بين تركيب الجمله، وبالتالي السماح باستخدام المتنوعة كيمياء تعديل الركيزة، بما في ذلك بدائل أليفة النواة متتابعة. وقد استخدمت ركائز هندسيا باستخدام هذه كيمياء للثقافة الخلية من قبل كلا منا 6،14 7 وغيرهم. وبالتالي، فإننا اندمجت R-μCP وردود الفعل استبدال شغوف بالنواة متتابعة لتطوير طريقة لصنع قابلة للمن ركائز الثقافة مع الاشارات الكيميائية الحيوية المعقدة وmicropatterned.Protocol
Representative Results
Discussion
سوف ركائز مثالية لهندسة الأنسجة وبالتالي يتم bioinspired ألخص التوزيع المكاني للبروابط النشطة بيولوجيا الحيوية الموجودة داخل أنسجة الأم. فإنها تمتلك أيضا خصائص الديناميكية التي تمكن التعديلات الزمنية للبروابط والأنماط المكانية التي يتم تقديمها للسماح توجه التشكل الأن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 mL | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2',2-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit – NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
