Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

La capacità delle superfici PEG-innestate per visualizzare leganti biochimici un legame covalente al tempo stesso mantenendo intrinseche proprietà non-fouling li rendono la scelta ideale per gli ambienti di microscala ingegneria personalizzate su substrati di coltura ^1,2,3 fare. Le interazioni biospecifici mediate da ligando coniugata spazzole PEG consente l'analisi riduzionistica degli effetti di segnali biochimici si trovano all'interno del complesso in microambienti tessuto vivo su fenotipi di cellule singole. Inoltre, chimiche "click" bio-ortogonale possono essere utilizzati per facilitare l'immobilizzazione direzionale di ligandi in modo che siano presentati in conformazioni native ^4-6. Così, microscala patterning spaziale di PEG spazzole è uno strumento versatile per creare design in nicchie in vitro per studiare la segnalazione cellulare indotta da stimoli biochimici immobilizzati ^6,7.

Un metodo comune per la generazione di modelli spaziali di cu biochimicaes comporta stampa microcontact (μCP) substrati d'oro rivestite con modelli di PEG alkanethiols coniugati. Poi, i monostrati auto-assemblati micropatterned (SAM) di alkanethiols PEG-ylated limita adsorbimento fisico di molecole biochimiche, ad esempio, le proteine, solo per le regioni non fantasia del substrato ^8,9. Tuttavia, i SAM generati da questa tecnica sono sensibili all'ossidazione a lungo termine mezzi di coltura cellulare. Così, μCP'd alkanethiol SAM sono spesso ulteriormente innestate con PEG spazzole polimero con trasferimento atomo-superficie avviato polimerizzazione radicalica (SI-ATRP) per aumentare non sporcare la stabilità della regione ^10. In particolare, μCP della iniziatore di polimerizzazione alkanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutirrato, su superfici d'oro rivestite seguite da SI-ATRP di poli (etilene glicole) metacrilato metil etere (PEGMEMA) monomeri genera superfici con micropatterned a lungo termine, stabile, e non fouling PEG spazzole. Inoltre, questi sono in grado di essere ulteriormente modificato per presentare frazioni chimiche diverse ^11.

Approfittando di questa proprietà, Sha et. al. messo a punto un metodo per progettare substrati di coltura con spazzole PEGMEMA più componenti presentano ortogonali chimiche "clic". In questo metodo, si avvalgono di una serie di passaggi μCP / SI-ATRP intervallati da sodio azide sequenziale, etanolammina, e propargylamine sostituzioni nucleofile per creare substrati di coltura che presentano modelli di microscala di più ligandi immobilizzati ^6. Mentre la prospettiva di utilizzare tali sostanze chimiche in collegamento con μCP manuale per progettare nuovi substrati di coltura è immenso, è limitata dalla precisione e accuratezza con cui più passaggi μCP possono essere allineate su un unico substrato. Un alto livello di precisione e accuratezza sarebbe necessario per la fabbricazione riproducibile complesso in nicchie vitro utilizzando queste tecniche versatili.

e_content "> Per affrontare questa limitazione, sono stati generati diversi sistemi μCP automatici e semi-automatici. Chakra et. al., messo a punto un sistema di μCP in cui timbri personalizzati sono posti su un sistema ferroviario e messi in contatto conforme con scivoli d'oro rivestite con un attuatore pneumatico controllato da computer. Tuttavia, questo metodo richiede la realizzazione precisa dei disegni provvisorie personalizzati e riporta una precisione di 10 micron con nessuna relazione della precisione ottenuta durante l'esecuzione multipla μCP passaggi ^12. Più recentemente, un metodo che utilizza un sistema di accoppiamento cinematico integrato precisione sotto riportato 1 micron utilizzando un singolo modello, ma non erano in grado di allineare con precisione più pattern a causa della mancanza di un controllo preciso delle caratteristiche provvisorie da stampo per stampo ^13. Inoltre, entrambi i metodi precedenti richiedono il substrato a rimanere fisso tra passi patterning , con ciò limitando sensibilmente la diversità dei chimici la modifica della superficie che possono essereutilizzata. Qui, descriviamo un sistema R-μCP automatizzato in grado di allineamento accurato e preciso di molteplici passaggi μCP pur consentendo la massima flessibilità nella progettazione e fabbricazione di bollo. Inoltre, i substrati modellati possono essere ripetutamente rimossi dal sistema tra frantumi, permettendo così l'uso di diverse sostanze chimiche modifica substrato, incluse sostituzioni nucleofile sequenziali. Substrati ingegnerizzati l'utilizzo di tali sostanze chimiche sono state utilizzate per colture cellulari in precedenza sia da noi ^6,14 e altri ^7. Così, abbiamo unito R-μCP e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali per sviluppare un metodo per la produzione scalabile di substrati di coltura con segnali biochimici complessi e micropatterned.

Protocol

1. Generazione elastomerici Francobolli Per generare padroni di silicio del timbro PDMS, di design dispongono di modelli del fotomaschere utilizzando il software computer-aided design. Progettare il primo modello come 20 x 20 serie di corone circolari con 300 micron di diametro interno (ID) e 600 micron OD con 1.200 micron da centro a centro spaziatura. Progettare il secondo pattern come 20 x 20 serie di corone circolari con ID 600 micron e 900 micron OD con 1.200…

Representative Results

L'uso di tecniche di allineamento μCP manuali per ingegnere substrati di coltura con array di spazzole PEG-innestate funzionalizzati con ortogonali "click" chimiche è stata dimostrata in precedenti lavori 6. Tuttavia, questo consente un controllo minimo dell'orientamento del modello e si traduce spesso in sovrapposizione delle aree funzionalizzati. Qui, un nuovo sistema R-μCP viene utilizzato per superare questa limitazione, e la sua capacità di precisione modello una serie di PEG pennel…

Discussion

Substrati ideali per l'ingegneria tissutale sarebbero bioispirati e quindi ricapitolano la distribuzione spaziale dei leganti critici bioattivi presenti all'interno dei tessuti nativi. Avrebbero anche possedere proprietà dinamiche che consentono regolazioni temporali dei leganti e dei modelli spaziali in cui sono presentati per consentire la morfogenesi dei tessuti diretto e spazialmente limitate induzione del destino cellulare. Fabbricazione di tali substrati richiede l'immobilizzazione di molteplici segna…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Higher end models with increased precision are available if desired.
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE	Gelest	SIT8174.0	CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides	Fisher Scientific	48393106	These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator	Telemark	SEC-600-RAP	Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities.
Schlenk Tube Flask 50 mL	Synthware	60003-078	Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate	Sigma Aldrich	447943	Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS)	Fisher Scientific	A412-4	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide	Sigma Aldrich	437867	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine	Sigma Aldrich	D216305	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate	Sigma Aldrich	C1297	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A7506
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190144
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663	Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate	Thermo Scientifit – NUNC	07-200-81	Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.