Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

A capacidade de superfícies PEG-enxertadas para exibir ligantes bioquímicos ligados covalentemente, mantendo simultaneamente propriedades inerentes não sujar torná-los uma escolha ideal para ambientes personalizados microescala engenharia em substratos de cultura ^1,2,3. As interacções bioespecíficas mediadas por ligando conjugado PEG escovas permite a análise minimizam os efeitos de sinais bioquímicos encontrados dentro do complexo em tecidos microambiente in vivo com fenótipos de células individuais. Além disso, a bio-ortogonal "click" químicas pode ser usada para facilitar a imobilização de ligandos direccional de modo a que eles estão apresentados na conformações nativas ^4-6. Assim, a modelagem espacial em microescala de PEG escovas é uma ferramenta versátil para criar projetista em nichos in vitro para investigar a sinalização celular induzida por sinais bioquímicos imobilizados ^6,7.

Um método comum para a geração de padrões espaciais de cu bioquímicaes implica impressão microcontact (μCP) substratos revestidos a ouro com padrões de PEG alcanotióis conjugados. Em seguida, as monocamadas auto-montadas micropatterned (MCS) de PEG-alcanotiois ylated restringe a adsorção física de moléculas bioquímicas, por exemplo, proteínas, apenas para as regiões não modelado do substrato ^8,9. No entanto, as SAM gerados por esta técnica são sensíveis à oxidação a longo prazo em meio de cultura celular. Assim, μCP'd alcanotiol SAMs são muitas vezes mais enxertado com escovas de polímero PEG utilizando a transferência de átomo iniciou-superfície polimerização radical (SI-ATRP) para aumentar a estabilidade não-incrustantes da região ^10. Especificamente, μCP do iniciador de polimerização alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superfícies revestidas com ouro seguido pela SI-PRTA de poli (etileno-glicol), éter metil metacrilato (PEGMEMA) monómeros gera superfícies com micropadronadas longo prazo, estável e não- incrustação PEG escovas. Além disso, estes são capazes de ser ainda modificado para apresentar diversas porções químicas ^11.

Aproveitando essa propriedade, Sha et. ai. desenvolveu um método para projetar substratos de cultura com escovas PEGMEMA multicomponentes apresentando ortogonais "clique" químicas. Neste método, que utilizam uma série de passos μCP / SI-ATRP intercaladas com azida de sódio sequencial, etanolamina, e propargilamina substituições nucleófilas para criar substratos de cultura apresentam padrões de microescala de múltiplos ligandos imobilizados ^6. Embora o potencial de utilização de tais produtos químicos, em conjugação com μCP manual para engendrar novos substratos de cultura é imensa, que é limitada pela precisão e exactidão com que múltiplos passos μCP podem ser alinhadas num único substrato. Um elevado nível de precisão e exactidão seria necessário para fabricar reprodutivelmente complexo em nichos in vitro que utilizam estas técnicas versáteis.

e_content "> Para resolver esta limitação, vários sistemas μCP automatizados e semi-automatizados foram gerados. Chakra et. al. desenvolveu um sistema em que μCP selos personalizados são colocados em um sistema de transporte ferroviário e colocada em contato conformada com lâminas revestidas de ouro, utilizando um atuador pneumático, controlado por computador. No entanto, este método requer a fabricação precisa de selo projetos personalizados e relata uma precisão de 10 mm sem relatório da precisão obtida ao executar múltiplos μCP etapas ^12. Mais recentemente, um método que utiliza um sistema de acoplamento cinemático integrado precisão relatado abaixo de 1 mm usando um único padrão, mas foram incapazes de alinhar com precisão múltiplos padrões, devido a uma falta de controlo preciso de características selo de molde para moldar a ^13. Além disso, ambos os métodos anteriores requerem o substrato para permanecer fixo entre os passos de modelação , assim, limitando significativamente a diversidade de produtos químicos de modificação de superfície que pode serutilizado. Aqui, nós descrevemos um sistema R-μCP automatizado capaz de alinhamento exato e preciso de várias etapas μCP, permitindo flexibilidade máxima em design e fabricação de selo. Além disso, os substratos modelado pode ser repetidamente removida do sistema entre estampadas, permitindo assim a utilização de diversos produtos químicos de modificação do substrato, incluindo substituições nucleófilas sequenciais. Substratos manipuladas usando tais produtos químicos têm sido usados ​​anteriormente para a cultura de células por ambos os nós e os outros ^{7 6,14.} Assim, fundiram-se R-μCP e reacções de substituição nucleofílica sequenciais de desenvolver um método para a fabricação de substratos de cultura escalonável com sinais bioquímicos complexos e micropatterned.

Protocol

1. Geração elastoméricos selos Para gerar mestres de silício do selo PDMS, padrões de design característica da fotomáscara usando software de desenho assistido por computador. Design o primeiro padrão como uma matriz de 20 x 20 dos anéis com 300 mm de diâmetro interno (ID) e 600 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro. Projetar o segundo padrão como 20 x 20 matriz de anéis com 600 mm ID e 900 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a…

Representative Results

A utilização de técnicas de alinhamento μCP manuais para engenheiro substratos de cultura com matrizes de escovas de PEG-enxertados funcionalizados com ortogonal "clique" químicas tem sido demonstrada em trabalhos anteriores 6. No entanto, este oferece um controle mínimo de orientação padrão e muitas vezes resulta em sobreposição de áreas funcionalizados. Aqui, um novo sistema R-μCP é usado para superar esta limitação, e sua capacidade de precisão padrão de um conjunto de PEG escov…

Discussion

Substratos ideal para a engenharia de tecidos seriam bioinspirado e, assim, recapitular a distribuição espacial dos ligandos bioactivos críticos encontrados dentro dos tecidos nativos. Eles também possuem propriedades dinâmicas que permitem ajustes temporais dos ligandos e os padrões espaciais, em que são apresentados para permitir a morfogénese do tecido e dirigida espacialmente restritos a indução de destino celular. Fabricação de tais substratos requer a imobilização de várias pistas bioquímicas nas o…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Higher end models with increased precision are available if desired.
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE	Gelest	SIT8174.0	CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides	Fisher Scientific	48393106	These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator	Telemark	SEC-600-RAP	Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities.
Schlenk Tube Flask 50 mL	Synthware	60003-078	Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate	Sigma Aldrich	447943	Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS)	Fisher Scientific	A412-4	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide	Sigma Aldrich	437867	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine	Sigma Aldrich	D216305	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate	Sigma Aldrich	C1297	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A7506
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190144
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663	Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate	Thermo Scientifit – NUNC	07-200-81	Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.