Här presenterar vi ett protokoll för att omvandla lin använder Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-dip. Detta protokoll är enkel att utföra och billig, men ändå ger en högre omvandlingsfrekvens än de nuvarande tillgängliga metoder för lin transformation.
Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-dip är en allmänt använd teknik inom området för växt omvandling och har rapporterats vara framgångsrika för många växtarter. Dock har lin (Linum usitatissimum) omvandling av blommor-dip inte rapporterats. Målet med detta protokoll är att fastställa att Agrobacterium och blommiga-dip-metoden kan användas för att generera transgena lin. Vi visar att denna teknik är enkel, billig, effektiv, och ännu viktigare, ger en högre transformationsfrekvens än de nuvarande tillgängliga metoder för lin omvandling.
Sammanfattningsvis var blomställningar av lin doppas i en lösning av Agrobacterium bär en binär vektor plasmid (T-DNA-fragment plus Linum Inser Sequence, LIS-1) för 1 – 2 min. Plantorna läggs platt på sin sida för 24 h. Då var växter bibehålls under normala odlingsförhållanden tills nästa behandling. Process av doppa upprepades 2-3 gånger, med ca 10-14 dagars mellanrum mellan doppning. De T1 fröna samlades in och gro på marken. Efter cirka två veckor, behandlades avkommor testas genom direkt PCR; 2-3 blad användes per växt plus lämpliga T-DNA-primrar. Positiva transformanter selekterades och odlades till mognad. Omvandlingen takten var oväntat hög, 50 – 60% av fröna från behandlade växter vara positiva trans. Det är en högre omvandlingsfrekvens än de som rapporterats för Arabidopsis thaliana och andra växtarter, som använder floral-dip förvandling. Det är också den högsta, som har rapporterats hittills, för lin transformation med andra metoder för transformation.
Lin (Linum usitatissimum) är en viktig gröda som odlas i stor utsträckning för sina fibrer och oljor. Transformation av lin-genomet är möjligt med tekniker såsom sårskada, Agrobacterium-infektion, och samodling i vävnadskultur, tillämpa biolistiska partiklar eller ultraljud sonikering följt av regenerering. Dessa tekniker har dock många nackdelar, bland proclivity till många mutationshändelser och en förlängd tid för att få de transgena linjerna. Vissa av dessa metoder kan också vara dyra och kräver kompetent och effektiv hantering av instrumenten, vilket resulterar i låga återvinnings plantor. Viktigast dessa teknik resulterar ofta i låga omvandlingshastigheter 2,6.
Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-dip är en enkel och effektiv metod för att generera transgena växter. Det har rutinmässigt och användes med framgång för många växtarter såsom från Arabidopsis Thalianen 1,4, Tornlusern 11, tomat 12, vete 13 och majs 10. Det har dock inte varit tänkt som en livskraftig teknik för lin omvandling på grund av flera faktorer, såsom det låga antalet blommor produceras av lin, begränsat antal frön som erhållits från varje blomma, den stora fröstorlek, och tjock päls, som också kan vara problematiskt för en sådan genetisk omvandlingsprocess. Dessutom valet segment av blommor-dip teknik kräver groende omvandlade frön på en anläggning media innehållande ett antibiotikum, med transforme avkommor särskiljas utifrån deras förmåga att gro och bo grönt, medan icke-transformerade avkommor antingen inte gror eller gro men blekmedel ut snabbt och dör. I den aktuella litteraturen, har det noterats att vildtyp lin tenderar att undkomma hög koncentration av antibiotika markeringar, producera falska positiva resultat, och gör valet av T1 progenies baseradeom antibiotikaresistens svårare 6,14. Också när en hög koncentration av antibiotika sattes till urvalsmediet, graden av observerade omvandling sjunkit dramatiskt 9.
I detta protokoll använde vi Agrobacterium och blommiga-dip metod för att omvandla en linje av spånadslin, Stormont cirrus (lyhörd och plast), vilket har visat sig svara på spänningar i miljön genom att ändra dess genom 3,5. För att övervinna den antibiotiska fly problemet, har vi valt att göra direkt PCR-testning av DNA från T1 blad, istället för val genom att lägga till antibiotika till anläggningen media. Vi drog fördel av den enkla anatomi lin att spåra specifika blommor vid tidpunkten för behandlingen. Detta system för spårning tillät urval av frön från specifika blommor och groning på marken utan att lägga antibiotika. Positiva trans var helt enkelt identifieras genom testning DNA erhållet från blad med hjälp av snabba och effektiva metoden of direkt PCR. Våra resultat visar att blom-dip-metoden fungerat mycket bra i denna linje av lin och överraskande resulterade i en mycket hög omvandlingsfrekvens (50-60%), högre än de som tidigare observerats för Arabidopsis thaliana, vilket rapporterades vara 0,1-1 % 1, och även högre än andra växtarter 10,12. Vi testade även en annan sort av linfrö (oljelin), Bethune (stabilt och icke-lyhörda), och vår preliminära data indikerar att floral-dip fungerar även för denna sort av lin.
Målet med detta protokoll är att visa att Agrobacterium och blommig-dip kan användas för att generera transgena lin. Vi visar att denna teknik är enkel, billig, och snabbare än andra metoder för lin omvandling. Viktigare det resulterar i en mycket högre omvandlingsfrekvens än andra metoder för lin transformation 2,6. Anatomi Arabidopsis thaliana, som har många grenar och blommor, makes det svårt att skilja doppat och icke-doppade blommor på samma planta. Därför ett stort antal frön, cirka 20.000 frön per planta, behöver screenas för att identifiera positiva trans 8. Flax, å andra sidan, har färre grenar (en huvudgren och några sidogrenar) och färre blommor, som producerar cirka 100 frön per växter, vilket gör det möjligt att spåra enskilda blommor och för att välja särskilt utsäde under screening process.
Vi föreslår att floral-dip är en tillämplig metod för att omvandla eventuella besläktade arter av lin, ett släkte av cirka 200 arter. Denna metod ger mycket högre omvandlingshastighet än andra metoder för lin omvandling. Vi föreslår också att den direkta PCR screening av T1 blad DNA är ett effektivt sätt att övervinna problemet med antibiotikaresistens flykt som ofta producerar många falska positiva. Direkt PCR-screening kan tillämpas på andra växtarter och är inte begränsad to lin. Den enkla spårning frö teknik som används i detta protokoll kan tillämpas på andra växtarter med förgrening anatomi liknar lin.
I vissa växtarter, såsom lin (Linum usitatissimum), har framgångsrikt växttransformation varit begränsad. Tidigare har omvandling i lin krävs en Agrobacterium infektion genom att såra och samodling, tillämpning biolistiska partiklar eller använda ultraljud ultraljudsbehandling, följt av regenere; en process som är både långa och benägna att åtföljas av många mutationshändelser. Vidare, urvalsprocessen av dessa tekniker kräver användning av antibiotikaselektionsmarkörer såsom kanamycin. Det har dock noterats i litteraturen att denna urvalsmetod producerar många falska positiva, som lin tenderar att fly höga koncentrationer av antibiotika 6,9,14. En annan nackdel med de tidigare teknikerna för lin omvandling har varit den låga omvandlingshastigheter 2,6.
I det protokoll som beskrivs här, Agrobacterium-medierad växttransformation via blommig-doppning visasatt resultera i en hög omvandlingsfrekvens för lin (50-60%). Transform erhölls från blommor doppade och samlats in från huvud- och sidogrenar. Val av positiva trans var helt enkelt gjort genom att odla T1 växter på jorden och screening sina blad snart efter att de grodda, förbi användning av antibiotikaselektion, ett steg som tidigare använts som en norm i blommig-dipp till andra växtarter. Genom att utföra direkta PCR-testning av löv, och med användning av lämpliga T-DNA-primrar, kan positiva trans snabbt väljas. Denna teknik är enkel, billig och lätt att utföra, men resulterar i en mycket högre omvandlingshastighet än de som tidigare rapporterats för Arabidopsis och andra växtarter med denna metod 1,10,12. Det är också den högsta rapporterade omvandlingsfrekvens för lin.
Men det finns kritiska steg i förfaranden, inklusive valet av den bästa blomman scenen och den bästa koncentrationen tensid, så attAgrobacterium kan tränga in i växtceller utan att döda blomman organ. Om ett tidigt knoppstadiet används (Figur 2A) med hög Silwet-77 koncentration av mer än 0,05%, kommer blomman utvecklas inte heller ställa frön. Om sen knoppstadiet används (figur 2C), även om omvandlingen kan fungera, kommer det att inträffa vid en mycket lägre takt. Liknande resultat erhölls med Arabidopsis blommig dopp transformation 1,4. För detta protokoll, alla blommor skeden testade med olika Silwet-77 koncentrationer och den bästa scenen bestämdes vara mittknoppstadiet (figur 2C) med Silwet-77 på 0,05% för den första doppning, följt av en andra doppning vid sen knoppstadiet (figur 2C) med en något reducerad Silwet-77 koncentration på 0,03%. Omvandlingen fungerade också bra att använda tidiga knoppstadiet (Figur 2A) med en låg Silwet-77 koncentration av 0,003%, följt aven andra doppning med mittknoppstadiet (Figur 2B) vid högre Silwet-77 koncentration av 0,05%.
I detta protokoll har några andra parametrar försökt optimera omvandlingsfrekvens, men fann att inte ha några effekter på det slutliga resultatet. Exempel inkluderar förlänga tiden efter doppa att växterna låg på deras sida och täckt i plast från en dag till två dagar; med användning av en OD av mer än en för Agrobacterium kultur, istället för 0,5-1; ökande doppningstiden till 5-15 min i stället för 1 – 2 min. Igen har vi inte märkt någon effekt på omvandlingen hastigheten med hjälp av dessa strategier. De mest effektiva faktorerna var emellertid befunnits använda friska växter på rätt blomma steg, och med hjälp av den bästa Silwet-77 koncentration. Vi märkte att två avbländande intervaller, fungerar på något sätt bättre än en gång, trots att en gång doppa fungerar också.
Ändring av detta protokoll kan uppnås genom reducing den Silwet-77 koncentration till så lite som 0,003% i det andra eller tredje doppning. Eftersom Silwet-77 är giftigt, för hög koncentration resultat i blommorna utvecklas dåligt, vilket resulterar i något fröskörd. Doppfrekvensen kan reduceras till en, med andra eller tredje händelser elimineras om växterna inte ser frisk och knopparna inte utvecklas väl.
En viktig begränsning med denna teknik är det låga antalet blommor produceras av lin, det begränsade antalet frön som erhållits från varje blomma, och den långa livscykel lin. Det tar 6 – 8 veckor från frö sådd att ha de primära knoppar redo för första doppa och en ytterligare 8-10 veckor efter doppning att komma till T1 generationen. Totalt, ett intervall av 5 – behövs 6 månader för att erhålla T1 generation. Till skillnad från andra växtarter, vilket blomma som helst på året, vissa linsorter blomma bättre på specifika tider på året. Så genomtänkt planering för denna teknik är viktigt.
<p class = "jove_content"> Sammanfattningsvis våra resultat av blom- dip med två olika linsorter: den spånadslinsektorerna Stormont Cirrus (responsiv och plast), och oljan lin, Bethune (stabila och icke-responsiva), visar att Agrobacterium – medierad växttransformation via floral-dip är en tillämplig och effektiv metod för lin transformation och kan användas för att ersätta de tidigare använda tekniker för lin transformation. De modifieringar av blommiga-dip-metoden i detta protokoll kommer att gälla för användning med andra växtarter och inte begränsat till lin.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ogelbay fund.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
5" pots | |||
potting soil | |||
greenhouse with appropriate light setting | |||
Thermocycler | |||
Agarose gel electropheresis equipment | |||
digital imaging setup | |||
Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
sucrose | fischer scientific | ||
electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
Shaker | |||
spinner | |||
platic wrap and aluminum foil wrap | |||
speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
Agar | fisher scintific | A360-500 |