Hög genomströmning Fluorometrisk Teknik för Bedömning av Macrophage Fagocytos och aktin polymerisation

Summary

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Abstract

Målet med fluorometrisk analys är att fungera som en effektiv, kostnadseffektiv, hög genomströmning metod för att analysera fagocytos och andra cellulära processer. Denna teknik kan användas på en mängd olika celltyper, både vidhäftande och icke vidhäftande, för att undersöka en mängd cellulära egenskaper. När man studerar fagocytos, utnyttjar fluorometrisk teknik fagocytiska celltyper såsom makrofager och fluorescerande opsoniserade partiklar vars fluorescens kan släckas i närvaro av trypanblått. Efter plätering av vidhäftande makrofager i 96-hålsplattor, fluorescerande partiklar (gröna eller röda) administreras och cellerna får fagocytera för varierande mängder av tid. Efter internalisering av fluorescerande partiklar, tvättas cellerna med trypanblått, vilket underlättar utrotning av fluorescerande signal från bakterier som inte är internaliserade, eller är enbart vidhäftar till cellytan. Efter trypan tvätt, tvättas cellerna med PBS, fixerades, ennd färgades med DAPI (kärnkraft blå fluorescerande märkning), som tjänar till att märka cellkärnor. Genom en enkel fluorometrisk kvantifiering genom platt läsning av nukleär (blå) eller partikel (röd / grön) fluorescens vi kan undersöka förhållandet mellan relativa fluorescensenheter av grönt: blått och bestämma en fagocytisk index som indikerar mängden fluorescerande bakterier intern per cell. Varaktigheten av analysen med hjälp av en 96-håls metod och flerkanalspipetter för tvätt, från slutet av fagocytos till slutet av datainsamling, är mindre än 45 min. Flödescytometri kan användas på ett liknande sätt men fördelen med fluorometri är dess hög genomströmning, snabb metod för bedömning med minimal manipulation av prover och snabb kvantifiering av fluorescensintensiteten per cell. Liknande strategier kan tillämpas på icke vidhäftande celler, levande märkta bakterier, aktin polymerisation, och i huvudsak alla processer som utnyttjar fluorescens. Därför är fluorometri en lovande metod för dess låga kostnader, hög throughpUT kapacitet i studiet av cellulära processer.

Introduction

Kvantifiering av fluorescerande signalen har ofta används i en mängd olika vetenskapliga metoder som spänner från PCR, flödescytometri, konfokalmikroskopi och FRET analyser att multiplexa ELISA. Fluorescens avbildning och kvantifiering har en bred tillämpning och kan vara ett bra verktyg för kvantitativ analys av olika cellulära processer. Användning av fluorescerande markörer och deras signal har revolution under det senaste decenniet, och uppkomsten av fluorescerande plattläsare har underlättat den höga genomströmningen kvantifiering av fluorescens som emitteras under cellulära processer.

Fluorometrisk analys kan fungera som ett bra verktyg i kvantifiering av fagocytos. Fagocytos har studerats sedan upptäckten av fagocyter från metchnikoff 1800 ^1. Under årens lopp har en mängd olika metoder använts för att undersöka denna viktiga process viktigt för medfödda immunförsvaret mot invaderande bakterier, virus, svamp och parasit patogener ^2-5. Tidigare metoder för kvantifiering utnyttjad mikroskopi och stereologisk tekniker för att visualisera celler som phagocytosing, som sedan kvantifierade genom räkning av internaliserade partiklar (manuellt eller med användning av programvara) ^6-8. Vissa nackdelar med att använda mikroskopi enbart för kvantitativ analys är att manuell räkning av bakterier är arbetsintensiv och mer benägna att observatörs partiskhet. En annan metod som används i kvantifiering av fagocytos är den mikrobiologiska tekniken med plätering av bakterier från cellysat (efter fagocytos) på bakterieodlingsplattor, men denna metod kan misslyckas med att redogöra för bakteriedödande mekanismer och förekomst av delvis interna bakterier. Denna metod är ännu mer arbetsintensiv jämfört med mikroskopi och tar flera dagar att analysera. Flödescytometri verkar vara den snabbaste, mest effektiva sättet att kvantifiera fagocytos och har använts av många grupper ^9-11, men de höga kostnaderna som vanligtvis förknippas med istrument som behövs för analysen gör det den dyraste metoden jämfört med de tidigare nämnda analyser.

Den fluorometriska metoden är ett bra alternativ till flödescytometri för analys av partikelinterna eftersom det ger opartisk kvantifiering av fluorescens använda utrustning som inte är så kostnads ​​oöverkomliga. Andra extra fördelar av fluorometri är hög effektivitet och hög genomströmning kapacitet för att kvantifiera fluorescens som avges av de märkta interna partiklarna.

Fördelar med fluorometri kan extrapoleras till kvantifiering av andra än fagocytos processer. Till exempel kan fluorometrisk analys tillämpas för att studera eventuella process som leder till förändringar i uttryck av intracellulära eller membranbundna receptorer, förändringar i cell permeabilitet / viabilitet, transfektion effektivitet, och modulering i aktin polymerisation. En nackdel med fluorometrisk teknik är att, beroende på vilka etiketter som används, kan det finnas en högexperiment experimentera variabilitet som vanligtvis kan lösas genom att visa data genom relativ kvantifiering, såsom faldig förändring eller procentig ökning från kontroll.

Protocol

OBS: Detta protokoll kan användas för flera tillämpningar såsom kvantifiering av fagocytos och aktin polymerisation som används i våra tidigare publicerade arbeten 12. Protokollet lämpar sig för en mängd olika modifikation, och typer Tabell 1 listor cell och partiklar med framgång används i tidigare studier. Standard användning av detta protokoll för kvantifiering av fagocytos eller aktin polymerisation illustreras i diagram 1. <p class="jove_content" fo:keep…

Representative Results

Två stora sätt att kvantifiera fagocytos och den efterföljande aktin polymerisation genom användning av detta protokoll är att observera kontinuerlig eller synkroniserad fagocytos. Mikroskopisk analys (Figur 1B) illustrerar fluorescerande bilder jämförbara med vad fluorometern spelar in (se även diagram 1). I figur 1B är röda fluorescens av aktin, grön 268 fluorescens av FITC etiketter HKOP E. coli, kärn DAPI fläcken, o…

Discussion

Större begränsningar av den fluorometriska tekniken är experimentella variansen liksom cellförlust associerad med omfattande tvättning och användning av icke-adherenta celler.

Varians observeras beror till stor del av variationen i fluorescerande partiklar som vägning och pipettering under beredning av stamlösning är inte en exakt sätt att bibehålla identiska nummer av partiklar från experiment till experiment. För att lösa problemet med variansen mellan experiment, kan uppgift…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use
Fluorescent plate reader-Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96 well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom – black plates
Multichannel pipette (8-12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)