In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Time-lapse in microscopia vivo negli organismi intatti permette la visualizzazione diretta di processi biologici complessi che sono inaccessibili ad un'analisi tradizionale unico punto-tempo, come immunoistochimica. In particolare, la microscopia multi-fotone (MPM) 1 permette l'imaging in dispersione tessuti, come la neocorteccia roditore, dove è stato raggiunto immagini fino a 2,3 e in eccesso su 4 1 mm. Quando combinato con preparazioni chirurgiche 5-7 in cui un singolo procedimento consente accesso ottico al cervello per settimane o mesi, questi approcci microscopia sono stati utilizzati per studiare processi dinamici nel cervello in stati sani e malati 8-11. Inoltre, sono stati sviluppati protocolli 12,13 che prevedono l'imaging in vivo in sveglio (cioè, non anestetizzati) animali, consentendo cellulari risoluzione imaging funzionale durante saggi comportamentali. Questi protocolli sono stati utilizzati per comparisons di correlata attività neuronale 14, astrociti calcio segnalazione 15 in animali anestetizzati e sveglio, l'identificazione di specifici task-clusters neuronali 16, e la capacità dei neuroni di discriminare posizione dell'oggetto su baffo stimolazione 17.
Dato il potenziale di questo approccio per chiarire i meccanismi sani e patologici, time-lapse imaging in vivo è stato applicato al midollo spinale del mouse (SC), consentendo l'identificazione di degenerazione assonale acuta (AAD) come meccanismo malattia 18. Studi successivi effetti di lesioni periferiche su gangli spinali (DRG) assone rigenerazione 19, il ruolo dei vasi sanguigni in assonale rigenerazione 20, chemiotassi gliali in risposta al danno 21, la migrazione delle cellule T in encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 22, l'attività indagati di microglia 23,24 e astrociti 25 in risposta a amyotrophsclerosi ic laterale (ALS), il ruolo di STAT-3 in sprouting assonale dopo la lesione SC (SCI) 26, e un meccanismo di perdita di assoni e recupero in EAE 27. Nonostante il successo di questi approcci, tutti questi studi sono stati limitati a una singola sessione di imaging, limitando così gli studi di dinamica a breve termine, o altrimenti richiesto ripetute aperture chirurgiche dell'animale in ogni punto di tempo di imaging, limitando il numero di punti di tempo accessibili e aumentando la probabilità di artefatti sperimentali confondenti. Protocolli per questi interventi sono stati pubblicati in precedenza 28,29.
Recentemente, abbiamo pubblicato una tecnica 30 per l'impianto di una camera spinale cronica che ha permesso time-lapse MPM immagini nel topo SC su più settimane senza la necessità di interventi di ripetizione. Brevemente, questa preparazione chirurgica inclusa eseguendo laminectomia nella colonna toracica inferiore e l'impianto di una camera di quattro parti. La camera inclusotre parti in acciaio inox custom-lavorati che serrate le vertebre che circonda la laminectomia, ed un vetrino di vetro posto sopra la SC e fissato con elastomero siliconico. Questa tecnica ha permesso per l'imaging di routine ad più di 5 settimane dall'intervento in stati sani e feriti, senza la necessità di interventi di ripetizione. Il numero di punti di tempo di imaging è stato limitato soltanto dalla frequenza alla quale l'animale può tollerare induzione anestetica. Imaging durata era limitata dalla crescita di una fitta, tessuto fibroso sulla superficie del SC. Inoltre, abbiamo verificato che l'impianto chirurgico non ha avuto effetto a lungo termine sulla funzione motoria.
Dato che la nostra prima pubblicazione, approcci alternativi che consentano anche di imaging a lungo termine nella SC sono stati descritti altrove 31-33. Questo protocollo dimostra la nostra procedura per impiantare la camera di midollo abbiamo sviluppato.
La tecnica dimostrata qui consente ripetute, temporizzata, imaging in vivo del mouse dorsali SC ad molte settimane post operativamente senza la necessità di ulteriori interventi chirurgici. Questa procedura rappresenta un notevole miglioramento rispetto studi di imaging repeat-chirurgia o su approcci istologici portmortem, dove le informazioni sulle dinamiche cellulari è perso. Abbiamo già 30 hanno dimostrato il valore di questa tecnica per lo studio SCI patologia in vivo.
La portata massima longitudinale di imaging è stato determinato dalla crescita di un denso tessuto fibroso sulla superficie dorsale del SC. Nel tempo, questa crescita ha portato alla perdita di contrasto e risoluzione. Questa crescita è stata vista anche in preparazioni chirurgiche alternative 31. Aneddoticamente, abbiamo osservato che questa crescita può essere minimizzato lavando accuratamente la superficie dorsale SC per rimuovere i prodotti del sangue, tenuta la superficie dil'osso taglio con cianoacrilato, bordi della camera di tenuta bene con elastomero di silicone, e minimizzando lo spazio interstiziale tra la SC dorsale e il vetro di copertura.
Recentemente, un altro approccio simile alla nostra con una camera di policarbonato è stata dimostrata 32. L'uso di policarbonato è vantaggioso poiché è compatibile con X-ray e modalità di imaging acustiche, che non è il caso per i nostri parti in acciaio inossidabile. Tuttavia, con la tecnologia ormai onnipresente di stampanti 3D, parti della camera possono essere fabbricati da un'ampia varietà di materiali per soddisfare esigenze specifiche. Abbiamo recentemente stampato tutte le nostre parti in un chiaro fotopolimero.
Uno svantaggio fondamentale di una camera chiusa è l'incapacità di amministrare ripetuti dosaggi di farmaci o coloranti esogeni adatti per l'imaging SC 34. Tuttavia, capitalizzando sulla stabilità meccanica del nostro sistema attuale, abbiamo già usato la nostra camera presente per il successoly ancorare un catetere intratecale collegato ad una porta di iniezione sottocutanea impiantato, che ha permesso per la consegna della droga in diversi punti temporali anche in un sistema di camera chiusa (inedito). Inoltre, a causa della natura modulare della piastra superiore, versioni future di questa preparazione includeranno una camera richiudibile per consentire l'applicazione ripetuta di entrambi gli agenti terapeutici e etichette fluorescenti. È anche possibile prevedere piastre superiori con supporti per la registrazione di elettrodi, inserti ottici e porte per drug delivery. Tali integrazioni sarebbe probabilmente più difficile attuare utilizzando il sistema più minimalista Fenrich et al. 31. In conclusione, la nostra camera offre una piattaforma di gateway su cui diversi esperimenti possono essere basati.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |