I denne videoen beskriver vi en prosedyre for å implantere en kronisk optisk avbildning salen over dorsal ryggmargen av en levende mus. Kammeret, kirurgisk prosedyre, og kronisk bildebehandling blir gjennomgått og demonstrert.
Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.
Time-lapse in vivo mikros i intakte organismer gjør det mulig direkte visualisering av komplekse biologiske prosesser som er utilgjengelige for tradisjonelle én-tidspunkt analyse, for eksempel immunhistokjemi. Nærmere bestemt tillater multi-foton mikroskopi (MPM) 1 for avbildning i sprednings vev, slik som gnager neocortex, hvor avbildnings opp til 2,3 og i overkant av fire 1 mm er oppnådd. Når den kombineres med kirurgiske preparater 5-7 hvori en enkelt prosedyre tillater optisk adgang til hjernen i uker til måneder, har disse mikros tilnærminger blitt brukt til å studere dynamiske prosesser i hjernen hos friske og syke tilstander 8-11. I tillegg har protokoller er utviklet 12,13 som sørger for in vivo avbildning i våken (dvs. ikke-bedøvede dyr), slik at for cellulær oppløsning funksjonell avbildning under atferdsmessige analyser. Disse protokollene har blitt brukt for comparisons av korrelerte neuronal aktivitet 14, astrocytt kalsiumsignalering 15 i bedøvede og våkne dyr, identifisering av oppgavespesifikke neuronal klynger 16, og evnen av nerveceller for å diskriminere objekt sted ved whisker stimulering 17.
Gitt den potensielle av denne tilnærmingen for å belyse sunne og patologiske mekanismene, time-lapse in vivo avbildning ble anvendt på mus ryggmargen (SC), slik at for identifisering av akutt aksonal degenerasjon (AAD) som en sykdomsmekanisme 18. Senere studier undersøkte effekten av perifere lesjoner på ryggmargen (DRG) axon regenerering 19, rollen av blodkar i axon regenerering 20, glial kjemotaksis i respons til skade 21, T-celle migrasjon i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) 22, aktivitet av mikroglia 23,24 og astrocytter 25 i respons til amyotrophic lateral sklerose (ALS), rollen STAT-3 i aksonal spirende etter SC skader (SCI) 26, og en mekanisme av axon tap og utvinning i EAE 27. Til tross for suksessen av disse metodene, ble alle disse studiene er begrenset til enten en enkelt avbildning økt, og dermed begrense studier for å korte dynamikk, eller ellers kreves gjentatt kirurgiske åpninger til dyret ved enhver tenkelig tidspunkt, noe som begrenser antallet tidspunkter tilgjengelige og øker sannsynligheten for konfunderende eksperimentelle gjenstander. Protokoller for disse operasjonene har vært publisert tidligere 28,29.
Nylig publiserte vi en teknikk 30 for implantering av en kronisk rygg kammer som mulig time-lapse MPM bildebehandling i muse SC over flere uker uten behov for gjentatt operasjoner. I korthet, dette inkludert kirurgiske preparatet utfører laminektomi i nedre thorax ryggraden og implantasjon av et firedelt kammeret. Kammeret inkluderttre tilpasset maskinerte deler av rustfritt stål som klemmes rundt ryggvirvlene laminektomi, og et dekkglass plasseres over SC og sikret med silikonelastomer. Denne teknikken er tillatt for rutine bildebehandling ut til mer enn fem uker postoperativt hos friske og skadde stater uten behov for gjentatt operasjoner. Antallet bilde tidspunkter var begrenset bare av frekvensen ved hvilket dyret kan tolerere bedøvelse induksjon. Imaging levetid var begrenset av veksten av et tett, fibrøst vev over overflaten av SC. I tillegg bekreftet vi at kirurgisk implantat hadde ingen langsiktig effekt på motorisk funksjon.
Siden vår første utgivelse, har alternative tilnærminger også muliggjør langsiktig bildebehandling i SC blitt beskrevet andre steder 31-33. Denne protokollen demonstrerer vår prosedyre for å implantere rygg kammer vi utviklet.
Teknikken vist her tillater gjentatt, time-lapse, in vivo avbildning av dorsal mus SC ut til mange uker etter operasjonen uten behov for etterfølgende operasjoner. Denne prosedyren representerer en betydelig forbedring i forhold til gjenta-kirurgi imaging studier eller over portmortem histologiske tilnærminger, der informasjon om cellulære dynamikk går tapt. Vi har tidligere demonstrert 30 verdien av denne teknikken for å studere SCI patologi in vivo.
Den maksimale langsgående utstrekning av avbildnings ble bestemt ved veksten av et tett, fibrøst vev i løpet av den dorsale overflate av SC. Over tid, resulterte dette vekst i tap av bilde kontrast og oppløsning. Denne veksten har også blitt sett i alternative kirurgiske forberedelser 31. Anecdotally, har vi observert at veksten kan reduseres ved forsiktig vasking av dorsal SC overflaten for å fjerne blodprodukter, tettende overflaten avkuttet ben med cyanoakrylat, tettende kanter av kammeret godt med silikon-elastomer, og å minimere den interstitielle rom mellom den dorsale SC og dekkglass.
Nylig har en annen tilnærming som ligner på vår egen ved hjelp av en polykarbonat kammer blitt vist 32. Bruken av polykarbonat er en fordel siden det er kompatibelt med X-ray og akustiske bildediagnostikk, som ikke er tilfelle for våre deler i rustfritt stål. Men med den nå utbredte teknologi for 3D-skrivere, kammer deler kan fremstilles av et bredt utvalg av materialer for å dekke spesielle behov. Vi har nylig skrevet ut alle våre deler i et klart fotopolymer.
En nøkkel ulempe med et lukket kammer er den manglende evne til å administrere gjentatte doser av legemidler eller eksogene fargestoffer som er egnet for avbildning SC 34. Men ved å utnytte den mekaniske stabiliteten i vårt nåværende system, vi har allerede brukt vår nåværende kammer til vellykketly forankre en intratekal kateter koblet til en subkutant implantert injeksjonsporten, som er tillatt for levering av legemidler ved flere tidspunkter selv i et lukket kammer system (upublisert arbeid). Videre, på grunn av den modulære naturen til topp-platen vil fremtidige versjoner av dette preparatet omfatte et kammer som kan lukkes for å tillate gjentatt anvendelse av både terapeutiske midler og fluorescerende markører. Det er også mulig å se for seg topplater med mounts for opptak elektroder, optiske inserts, og havner for levering av legemidler. Slike tilsetninger vil trolig være mer utfordrende å gjennomføre bruke mer minimalistisk system av Fenrich et al. 31. I konklusjonen, gir vår kammer en gateway plattform hvor ulike eksperimenter kan være basert.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-04 | |
forceps, scissors, scalpel, etc. | Fine Science Tools | multiple | |
retractor kit -magnetic fixator | Fine Science Tools | 18200-02 | |
retractor kit -retractor | Fine Science Tools | 18200-09 | other retractors may also be used |
retractor kit -elastomer | Fine Science Tools | 18200-07 | |
feedback controlled heating blanket | CWE Inc. | Model: TC-1000 Mouse Part No. 08-13000 | |
stereotax | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
spinal chamber holders | N/A | see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online) | |
Cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite 495 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder) | Teets | Mfg. Part: 8101 | multiple suppliers |
Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid) | Teets | Mfg. Part: 8501 | multiple suppliers |
Glycopyrrolate | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
Bupivacaine | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 029841 (Hospira 116301) | |
Ketoprofen | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193) | |
Dexamethasone | MWI Veterinary Supply | MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032) | |
KwikSil Elastomer | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
KwikSil Mixing Tips | World Precision Inc. | KWIKMIX |