We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
ديناميكية الجزيئات واحدة على الخلايا الحية تساهم في الوظيفة البيولوجية الخاصة بهم. التصوير مضان جزيء واحد هو وسيلة شعبية لدراسة ديناميكية الجزيئات واحدة على 1،2،3 سطح الخلية. ومع ذلك، فإن تحقيقات التصوير الأكثر شيوعا في هذه الدراسات لها عيوب عديدة مهمة. على سبيل المثال، والأصباغ العضوية والبروتينات الفلورية التقليدية توفر سطوع معتدل، حوالي 10 -10 5 6 M -1 سم -1، ولكن غير مستقرة ضوئيا، وتبيض بعد انبعاث حوالي 10 -10 5 6 الفوتونات في ظل ظروف التصوير الخلية الحية النموذجية 4،5. في المقابل، أشباه الموصلات النانوية، وعادة ما يطلق نقاط الكم (QDS)، هي أكثر إشراقا بكثير وأكثر استقرارا، مع معاملات الانقراض في حدود 10 -10 6 7 M -1 سم -1 وتتجاوز 10 -10 7 8 الفوتونات المنبعثة قبل photobleaching 5. تحسن السطوع وصمود من QDS على fluorophores العضوية يتيح مراقبة الجزيئات واحدة في أسرع بشكل ملحوظ معدلات الإطار وأكثر من 6 مسارات أطول بكثير.
على الرغم من مزاياها والتوافر التجاري، لا تزال عدة التزامات لهذه العوامل التصوير قوية. أولا، أنها محددة بشكل واضح استهداف التكافؤ، مما قد يؤدي في يشابك من الجزيئات الحيوية المستهدفة 6. الثانية، لديهم عادة حجم كبير الهيدروديناميكية (> 20 نانومتر) الذي يحد من إمكانية الوصول إلى بعض البيئات المزدحمة الخلوية 7. ثالثا، أنها حدت من استهداف نمطية 7. وقد حاول العديد من الاستراتيجيات لمعالجة هذه المشاكل 8،9،10، ولكن عموما تتطلب معرفة متخصصة والكواشف لتنفيذها.
لمعالجة هذه المشاكل، ونحن ذكرت مؤخرا استراتيجية "استبعاد الفراغية" لإعداد الأحادي التكافؤ، صغيرة، ووحدات QDS 11. هي ملفوفة في QDS مع DNA phosphorothioate طويلة (ptDNA) البوليمر واحد. وptDNA يربط إلى السطح QD متعددة من خلال التفاعل بين الزنك-S-تتعرض سطح ذرات الزنك والجماعات phosphorothioate من البوليمر ptDNA. بوليمر المربوطة واحد sterically وكهربية يستبعد الربط مكافئات إضافية من البوليمر دون زيادة كبيرة الحجم الكلي الجسيمات (حوالي 2 نانومتر). كلها الكواشف المتاحة تجاريا، وتشكل المنتجات عالية الغلة، وهذه العملية تتطلب سوى خطوات تحلية لتنقية. مرة واحدة المسمى، QDS ملفوفة مع ptDNA (mQDs) ربط واحد للحمض النووي مكملة تحمل تستهدف المجالات (على سبيل المثال، benzylguanine (BG)، benzylcytosine، أو alkylhalides).
هذه الوظائف تستهدف mQDs تحديدا إلى علامات الأنزيمية مثل SNAP، وCLIP HALO التي تنصهر فيها وراثيا لبروتين من الفائدة. هذا هو بروتوكول لتوليف، الاستهداف، والتصوير الخلية الحية من mQDs التي تنتجها استبعاد الفراغية.
على نمطية للتصميم mQD يمكن زيادة درجة المرونة التجريبية. على سبيل المثال، مجموعة متنوعة من mQDs يمكن إعداد بسرعة بألوان فريدة تسمح التصوير المتزامن لأهداف متعددة. تسلسل استهداف ssDNA يمكن توجيه mQDs إلى البروتينات، والسكريات 12، والدهون والأسطح 13. وهناك عدد من العلامات الأنزيمية المتاحة مع نشاطية متعامدة، مما يسمح لأهداف متعددة في وقت واحد يمكن تصوير مع mQDs المستهدفة بشكل مختلف. وبالإضافة إلى استهداف مع العلامة SNAP، كان وسم البروتينات الهدف مع mQDs باستخدام علامة CLIP، العلامة HALO، والبروتينات المعقدة البيروكسيديز ناجحة أيضا. يوضح هذا البروتوكول وصفها محدد من المستقبلات على سطح الخلايا الحية مع هذه mQDs، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول لعدد من السياقات المختلفة.
البصيرة المنهجية الهامة في إنتاج mQDs مع تكافؤ محددة هي أن ~ المرتبطة phosphorothioate 50هناك حاجة إلى التفاف قواعد QDS (وبالتالي منع جزيئين من الملزم في وقت واحد). A-A بولي تسلسل S 50 بتكاثر ومستقر ملزمة QDS 605 نانومتر من تقنيات الحياة. على الرغم من أنه تم وقف هذا المنتج، واستراتيجية الإقصاء الفراغية هي تعميم لمنتجات مماثلة من موردين آخرين جود مختلف الأحجام والأشكال، والخصائص الطيفية.
كفاءة واستقرار QDS ptDNA الملفوفة تعتمد بشكل كبير على الكيمياء السطحية وهيكل QDS. وبالتالي، فإن نجاح بروتوكول تعتمد على بنية مصدر والكيميائية التجاري للQDS. لأغراض هذا البروتوكول، وهناك ثلاث نقاط رئيسية للفرق بين مصادر تجارية مختلفة من QDS: اختلاف في الشروط اللازمة لنقل المرحلة. الفرق في قوة الأولي ملزم PEG-ثيول يجند، ربما تعوق التشريد من قبل ptDNA. واختلاف في كمية يتعرض CdSe الأساسية، والتي يمكن جنيهإعلان للتبريد من QD من قبل MPEG شروط نقل المرحلة ثيول.
والنشر، QDS مع أفضل بنية لإنتاج mQDs هي 4-10 QDS نانومتر CdSe / اغشية الأساسية / شل شراؤها من تقنيات الحياة مع أطياف الانبعاثات في 545، 585، 605 و 625 نانومتر (الشكل 2A). QDS استنادا إلى صياغة "حية" (545، 605، الخ) على إخماد إضافة MPEG ثيول وغير مناسبة لهذا التطبيق. QDS من الدريتش والمحيط تكنولوجيا النانو تعمل بشكل جيد، ولكن تتطلب خطوات نقل مرحلة أطول والمعالجة المسبقة مع أكسيد trioctylphosphine. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لQDS من تقنيات الحياة.
يتم إنهاء تسلسل بولي-A phosphorothioate تستخدم لالتفاف QDS مع الأصلي 20 مير ذيل DNA تحتوي على تسلسل (ACTG) 5 التي تستهدف حبلا قد هجن. هذا التسلسل غير مريحة، كما أن لديها قليل من دون هيكل الثانوي، وسيظل hybridizإد عند 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني. إذا كان هناك إمكانية الوصول إلى المزج الحمض النووي، يمكن للptDNA توليفها من ثم تنقيته بواسطة عكس المرحلة اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) باستخدام عمود C 8. سوف ptDNA أزل في وقت لاحق على HPLC من أليغنوكليوتيد] تعادل مع العمود الفقري الأصلي. نحن عادة ترك 5 'DMT حماية المجموعة على أليغنوكليوتيد] phosphorothioate لدينا بعد تنقيتها.
مطلوب عادة التخميل من QDS ptDNA ملفوفة في أجل تحسين الاستقرار الغروية من QDS والحد خلفية ملزمة لمعظم التطبيقات التجريبية. يستخدم بروتوكول طبقة من PEG-إيقاف فاعلية وQDS. كربوكسي PEG ثيول ألكان مع وحدات إضافية PEG ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH، كربوكسي-PEG12 ثيول ألكان) يوفر انخفاض كبير الخلفية، على الرغم من أن أوتاد أطول على حد سواء أكبر، وعموما أكثر تكلفة. mQDs المغلفة مع كربوكسي PEG الكابروابط ثيول شمال شرق مستقرة للغاية في مخازن الفسيولوجية مثل ملاحات الفوسفات مخزنة وسائل الإعلام والثقافة. أظهر تخزين على المدى الطويل (> 8 أشهر) من mQDs في 4 درجات مئوية أي تجميع كبير أو ptDNA مفرزة 11. تبعا للتجربة، PEG التخميل من QDS وحده لا يقلل بما فيه الكفاية دائما غير محددة وملزمة للmQDs. احتضان كل من الخلايا وmQDs في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 3٪ BSA لمدة 20 دقيقة قبل استخدامها يقلل إلى حد كبير غير محددة ملزمة للخلايا، على الرغم من أنه لا يزيد نصف قطرها الهيدروديناميكية واضح من قبل mQDs ~ 50٪. التخميل مع 0.5٪ يقلل من الكازين غير محددة ملزمة أبعد من ذلك ولكن لأنه يزيد من حجم واضحا إلى حد أكبر من BSA.
5 'نهاية حبلا الحمض النووي مكملة لmQDs يمكن تعديلها لتمكين استهداف عدد من الجزيئات الحيوية المختلفة. هناك عدد من التقنيات المتاحة لتأسيس تعديل تساهميا البروتينات، لipids والسكريات مع الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA). طالما يتم تقديم ssDNA خارج الخلية، فإنه يمكن الوصول إلى mQDs قابل للذوبان. سوف mQDs مع تسلسل أعلاه هجن بسرعة مع حبلا الحمض النووي التكميلي في ظل ظروف ثقافة الخلية. و10-20x بولي (CT) فاصل بين ptDNA وتسلسل استهداف قد تكون هناك حاجة لكفاءة استهداف وذلك لرفع تسلسل ملزمة فوق الكنان السكري سميكة وذات الشحنة السالبة للخلية. لهذا البروتوكول اخترنا لإنتاج DNA-BG مع سلسلة متكاملة من (CAGT) 5 من شأنها أن كلا تهجين إلى mQDs وتساهميا ربط نفسه إلى البروتين SNAP-علامة لوصفها سريع ومحدد. وظائف بروتوكول مماثلة تماما لاقتران أخرى NHS-استرات ل[أليغنوكليوتيد المعدلة الأمينية.
للتصوير جزيء واحد، وعادة ما تتطلب كثافة منخفضة من وضع العلامات لحل الجزيئات الفردية. وهناك تركيز mQD النهائي ~ 0.5 نانومتر في برنامج تلفزيوني مع وكيل تخميلهو هدف جيد. ومع ذلك، أدت هذه التخفيفات عالية أحيانا في ظل وضع العلامات من الخلايا. إذا حدث هذا، يمكن أن تضاف إضافية mQD حتى لوحظ كثافة المثلى لوضع العلامات. في حالة SNAP الموسومة Notch1 البشري، تركيزات> 10 نانومتر mQD أنتجت خلايا وضع العلامات كثيفة بينما أسفرت 0.5 نانومتر mQD في المرفق من ~ 20 mQDs على السطح القاعدي الخلايا المستهدفة (انظر الشكل 4B). كان وضع العلامات خلية مع mQDs يعتمد بشكل كبير من الخلايا confluency مطلي. مفرطة في خلايا متكدسة لا التسمية في السطوح القاعدية الخاصة بهم.
باختصار، طريقة بسيطة لتوليد أحادي التكافؤ وصفت QDS وحدات. هذه mQDs تجد فائدة في مجموعة واسعة من تطبيقات التصوير الخلية الحية، كما يتبين من تصوير مستقبلات الشق على الخلايا U2OS الحية. تطبيق mQDs لا يقتصر على هذه الحالة المحددة، ولكن يمكن تمديد يحتمل للأهداف الخلوية الأخرى مثل البروتينات الأخرى، والأحماض النووية، والإنزيمات.
The authors have nothing to disclose.
التمويل المقدم من قبل وزارة الدفاع W81XWH-1023/10/01 (ZJG)، منحة GM081879 P50 من مركز UCSF للنظم والبيولوجيا الاصطناعية (ZJG)، NIH 5R21EB015088-02 (YJ)، والمعاهد الوطنية للصحة 1R21EB018044 (ZJG وYJ). وأيد DS بواسطة برنامج العلوم الحدودي الإنسان العابرة بعد الدكتوراة التخصصات الزمالة البحثية.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |