We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
La dynamique de molécules uniques sur cellules vivantes contribue à leur fonction biologique. Simple fluorescence de molécules imagerie est une méthode populaire pour étudier la dynamique de molécules uniques sur le 1,2,3 de la surface cellulaire. Cependant, les sondes d'imagerie les plus couramment utilisés dans ces études présentent plusieurs inconvénients importants. Par exemple, les colorants organiques et les protéines fluorescentes conventionnelles offrent luminosité modérée, environ 10 5 à 10 6 M -1 cm -1, mais sont photochimiquement instable, le blanchiment après l'émission de l'ordre de 10 5 -10 6 photons dans les conditions typiques d'imagerie en temps réel des cellules 4,5. En revanche, les nanoparticules semi-conductrices, souvent appelés points quantiques (QD), sont nettement plus brillant et plus stable, avec des coefficients d'extinction dans la gamme de 10 6 à 10 7 M -1 cm -1 et de plus de 10 7 -10 8 photons émis avant photoblENSEIGNEMENT 5. La luminosité améliorée et photostabilité des boîtes quantiques plus de fluorophores organiques permet l'observation de molécules uniques à une accélération significative du taux de trame et trajectoires sur beaucoup plus longtemps 6.
Malgré leurs avantages et la disponibilité commerciale, plusieurs engagements restent pour ces agents d'imagerie puissantes. Tout d'abord, ils ont mal défini ciblage valence, ce qui peut entraîner une réticulation des biomolécules cibles 6. Deuxièmement, ils ont généralement une taille hydrodynamique (> 20 nm) qui limite l'accès à certains environnements cellulaires encombrés 7. Troisièmement, ils ont limité le ciblage modularité 7. Plusieurs stratégies ont tenté de répondre à ces problèmes 8,9,10, mais exigent généralement des connaissances et des réactifs spécialisés pour la mise en œuvre.
Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment signalé une stratégie «d'exclusion stérique" pour préparer monovalent, petites etmodulaires QD 11. Les points quantiques sont emballés avec un seul polymère ADN phosphorothioate longue (ptDNA). Le ptDNA se lie à la surface par l'intermédiaire d'interactions multiples QD Zn-S entre les atomes de Zn exposées à la surface et les groupes phosphorothioate du polymère ptDNA. Un seul polymère lié de manière électrostatique et stérique exclut la liaison des équivalents supplémentaires du polymère sans augmenter de manière significative la taille globale de la particule (environ 2 nm). Tous les réactifs sont disponibles dans le commerce, les produits sont formés avec un rendement élevé, et le procédé nécessite seulement des étapes de purification de dessalage. Une fois marqué, les points quantiques emballés avec un seul bind ptDNA (mQDs) à des brins d'ADN complémentaires portant ciblant les domaines (par exemple, benzylguanine (BG), benzylcytosine ou alkylhalogénures).
Ces fonctionnalités ciblent spécifiquement les mQDs à étiquettes enzymatiques tels que la SNAP, CLIP & HALO qui sont génétiquement fusionnés à la protéine d'intérêt. Il s'agit d'un protocole de synthèse, Le ciblage et l'imagerie des cellules vivantes de mQDs produites par exclusion stérique.
La modularité de la conception MQD permet un accroissement du niveau de flexibilité expérimentale. Par exemple, une variété de mQDs peuvent être préparés rapidement en couleurs uniques permettant l'imagerie simultanée de multiples cibles. La séquence de ciblage ADN simple brin peut diriger mQDs de protéines, de sucres, de lipides et 12 surfaces 13. Un certain nombre de balises enzymatiques sont disponibles avec des réactivités orthogonales, permettant à plusieurs cibles à imager simultanément avec mQDs différemment ciblées. En plus de cibler avec l'étiquette de SNAP, l'étiquetage des protéines cibles avec mQDs utilisant la balise CLIP, l'étiquette de HALO, et des protéines biotinylées a également été couronnée de succès. Ce protocole montre le marquage spécifique d'un récepteur de surface de cellules vivantes avec ces mQDs, mais le protocole peut être facilement adapté à un certain nombre de contextes différents.
L'idée méthodologique important dans la production de mQDs de valence est défini que ~ 50 phosphorothioate-liébases sont nécessaires pour envelopper les boîtes quantiques (et éviter ainsi deux molécules de liaison simultanément). A-Une séquence poly S 50 reproductible et liée de façon stable 605 nm boîtes quantiques de Life Technologies. Bien que ce produit a été abandonné, la stratégie d'exclusion stérique est généralisable à des produits similaires d'autres fournisseurs ayant des tailles différentes, des formes, des propriétés spectrales.
L'efficacité et la stabilité des boîtes quantiques ptDNA emballés dépendent essentiellement de la chimie de surface et la structure des boîtes quantiques. Par conséquent, la réussite d'un protocole dépend de la structure chimique et de la source commerciale des points quantiques. Pour les fins du présent protocole, il existe trois principaux points de divergence entre les différentes sources commerciales de boîtes quantiques: une différence dans les conditions nécessaires pour le transfert de phase; une différence dans la force initiale de PEG-thiol-ligand de liaison, peut entraver le déplacement par ptDNA; et une différence dans la quantité de CdSe noyau exposé, qui peut leannonce à la trempe de la QD par les conditions de transfert de phase thiol MPEG.
Dès la publication, les points quantiques avec la meilleure structure pour la production de mQDs sont les points quantiques 4-10 nm CdSe / ZnS base / shell achetés auprès de Life Technologies avec des spectres d'émission à 545, 585, 605 et 625 nm (figure 2A). QD basées sur la formulation «Vivid» (545, 605, etc) étanchent lors de l'ajout de mPEG thiol et ne conviennent pas pour cette application. QD de Aldrich et océan Nanotech fonctionnent bien, mais nécessitent des étapes de transfert de phase et plus prétraitement avec de l'oxyde de trioctylphosphine. Ce protocole a été optimisé pour les points quantiques de Life Technologies.
La séquence poly-A phosphorothioate utilisé pour envelopper les boîtes quantiques est terminé par une queue d'ADN 20-mère contenant la séquence native de (ACTG) 5 dans laquelle un brin de ciblage peut s'hybrider. Cette séquence est commode, car il a peu ou pas de structure secondaire, et restera hybridized à 37 ° C dans du PBS. Si on a accès à un synthétiseur d'ADN, par la ptDNA peut alors synthétisé et purifié par Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) utilisant une colonne C 8. Le ptDNA éluera plus tard sur la HPLC que oligonucléotides équivalentes à squelette natif. Nous laissons généralement 5 'DMT groupe protecteur sur nos oligonucléotides phosphorothioates après purification.
Passivation des boîtes quantiques ptDNA-emballés est généralement nécessaire pour améliorer la stabilité colloïdale des boîtes quantiques et réduire la liaison pour les applications les plus expérimentales fond. Le protocole utilise un PEG-couche de passivation les boîtes quantiques. Carboxy PEG de alcanethiol avec des unités supplémentaires de PEG ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, carboxy-PEG12 alcane thiol) contribuent à réduire de manière significative fond, si les PEG plus sont à la fois plus grande, et généralement plus coûteux. mQDs revêtus de carboxy PEG alkaligands thiols nes sont très stable dans des tampons physiologiques tels que le phosphate tamponnée salines et les milieux de culture. Stockage à long terme (> 8 mois) de mQDs à 4 ° C n'a montré aucune agrégation significative ou détachement ptDNA 11. En fonction de l'expérience, le PEG passivation des points quantiques ne pas toujours seul réduire suffisamment la liaison non spécifique des mQDs. L'incubation des cellules et les deux mQDs dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 3% de BSA pendant 20 minutes avant utilisation permet de réduire sensiblement la liaison non spécifique à des cellules, bien que cela augmente le rayon hydrodynamique apparent des mQDs de ~ 50%. Passivation avec 0,5% de caséine réduit la liaison non spécifique, mais encore elle augmente la taille apparente d'une plus grande mesure que la BSA.
L'extrémité 5 'd'un brin d'ADN complémentaire à la mQDs peut être modifié pour permettre le ciblage d'un certain nombre de différentes biomolécules. Il existe un certain nombre de techniques disponibles établies pour modifier de manière covalente les protéines, lipids et des sucres à l'ADN simple brin (ADN simple brin). Tant que l'ADNsb est présentée de façon extracellulaire, il est accessible à mQDs solubles. mQDs avec les séquences ci-dessus seront rapidement s'hybrider avec leur brin d'ADN complémentaire dans des conditions de culture cellulaire. Un 10-20x poly (CT) entretoise entre la ptDNA et la séquence de ciblage peut être nécessaire pour le ciblage efficace de façon à élever la séquence de liaison au-dessus de la glycocalyx épaisse et chargée négativement de la cellule. Pour ce protocole, on a choisi pour produire un ADN-BG avec une séquence complémentaire de (CAGT) 5 qui sera hybridée à la fois aux mQDs covalente et se lier à une protéine SNAP-tag pour le marquage rapide et précis. A fonctions protocolaires similaires bien pour le couplage d'autres esters NHS à oligonucléotides aminés modifiés.
Pour l'imagerie de molécules simples, une faible densité de marquage est typiquement nécessaire pour résoudre des molécules individuelles. Une concentration MQD finale de ~ 0,5 nM dans du PBS avec agent de passivationest une bonne cible. Cependant, ces dilutions élevées parfois donné lieu à une sous-marquage des cellules. Si cela se produit, MQD supplémentaire peut être ajouté jusqu'à une densité optimale de marquage n'est observé. Dans le cas de Notch1 humain SNAP-marqués, les concentrations de> 10 nM MQD cellules produites à l'étiquetage denses tandis que 0,5 nM MQD conduit à la fixation de ~ 20 mQDs à la surface de base de cellule cible (voir la figure 4B). étiquetage portable avec mQDs était fortement tributaire de la confluence de cellules étalées. Trop cellules confluentes ne pas étiqueter leurs surfaces de base.
En résumé, une méthode simple pour générer monovalent et boîtes quantiques modulaires a été décrite. Ces mQDs trouvent une utilité dans une large gamme d'applications d'imagerie des cellules, tel que démontré par l'imagerie du récepteur Notch sur les cellules vivantes U2OS. Applicabilité de mQDs n'est pas limitée à ce cas particulier, mais peut être étendu à d'autres potentiellement des cibles cellulaires tels que d'autres protéines, acides nucléiques et les enzymes.
The authors have nothing to disclose.
Le financement accordé par le DOD W81XWH-01.10.1023 (ZJG), subvention P50 GM081879 du Centre UCSF pour les systèmes et la biologie synthétique (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) et NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS a été soutenu par le programme Human Frontier Science croisée postdoc disciplinaire bourse de recherche.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |