We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
जीवित कोशिकाओं पर एकल अणुओं की गतिशीलता उनके जैविक समारोह के लिए योगदान देता है. एकल अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग कोशिका की सतह 1,2,3 पर एक अणु गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय तरीका है. हालांकि, इन अध्ययनों में सबसे अधिक इस्तेमाल किया इमेजिंग जांच कई महत्वपूर्ण नुकसान है. उदाहरण के लिए, पारंपरिक जैविक रंगों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन -1 के बारे में 10 5 -10 6 एम, सेमी -1 उदारवादी चमक प्रदान करते हैं, लेकिन photochemically अस्थिर कर रहे हैं, ठेठ रहते सेल इमेजिंग शर्तों के तहत लगभग 10 5 -10 6 फोटॉनों के उत्सर्जन के बाद विरंजन 4,5. इसके विपरीत, अर्धचालक नैनोकणों, अक्सर कहा जाता है क्वांटम डॉट्स (QDs), 10 6 -10 7 एम -1 सेमी -1 की रेंज और photobl से पहले 10 7 -10 8 उत्सर्जित फोटॉनों से अधिक में विलुप्त होने के गुणांक के साथ, काफी उज्ज्वल है और अधिक स्थिर हैं5 eaching. जैविक fluorophores अधिक QDs के बेहतर चमक और photostability काफी तेजी से फ्रेम दर पर एकल अणुओं के अवलोकन और अधिक बहुत लंबे समय तक 6 trajectories सक्षम बनाता है.
अपने फायदे और वाणिज्यिक उपलब्धता के बावजूद, कई देनदारियों इन शक्तिशाली इमेजिंग एजेंट के लिए रहते हैं. पहला, वे खराब लक्षित biomolecules 6 के crosslinking में हो सकता है जो लक्षित कर संयोजकता, परिभाषित किया है. दूसरा, वे आम तौर पर कुछ भीड़ सेलुलर वातावरण 7 तक पहुँच को सीमित करता है कि एक बड़े hydrodynamic आकार (> 20 एनएम) है. तीसरा, वे प्रतिरूपकता 7 को लक्षित सीमित है. कई रणनीतियों इन समस्याओं 8,9,10 को संबोधित करने का प्रयास किया, लेकिन आम तौर पर लागू करने के लिए विशेष ज्ञान और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है.
इन समस्याओं का समाधान करने के लिए, हमने हाल ही में monovalent, छोटे तैयार करने के लिए एक "steric बहिष्करण" रणनीति की सूचना दी, औरमॉड्यूलर QDs 11. QDs एक भी लंबे phosphorothioate डीएनए (ptDNA) बहुलक के साथ लिपटे रहे. ptDNA सतह उजागर Zn परमाणुओं और ptDNA बहुलक की phosphorothioate समूहों के बीच कई Zn एस बातचीत के माध्यम से QD सतह को बांधता है. एक एकल बाध्य बहुलक sterically और electrostatically काफी कण के समग्र आकार (लगभग 2 एनएम) में वृद्धि के बिना बहुलक के अतिरिक्त समकक्ष के बंधन शामिल नहीं है. सभी अभिकर्मकों उत्पादों को उच्च उपज में बनते हैं, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और इस प्रक्रिया शुद्धि के लिए ही desalting चरणों की आवश्यकता है. एक बार को निशाना डोमेन (जैसे, benzylguanine (बीजी), benzylcytosine, या alkylhalides) असर पूरक किस्में डीएनए के लिए एक एकल ptDNA (mQDs) बाँध के साथ लिपटे QDs लेबल.
ये कार्यक्षमताओं आनुवंशिक रूप से ब्याज की प्रोटीन के लिए जुड़े हुए हैं कि इस तरह की तस्वीर, क्लिप और हेलो के रूप में एंजाइमी टैग करने के लिए विशेष रूप से mQDs लक्ष्य. इस संश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल है, लक्ष्यीकरण, और steric अपवर्जन द्वारा उत्पादित mQDs का जीना सेल इमेजिंग.
mQD डिजाइन की प्रतिरूपकता प्रयोगात्मक लचीलापन की एक वृद्धि की डिग्री सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, mQDs की एक किस्म जल्दी से कई लक्ष्यों के साथ इमेजिंग के लिए अनुमति अद्वितीय रंगों में तैयार किया जा सकता है. ssDNA को लक्षित अनुक्रम, प्रोटीन को शक्कर 12, लिपिड mQDs प्रत्यक्ष और 13 सतहों कर सकते हैं. एंजाइमी टैग की संख्या कई लक्ष्यों को विभिन्न लक्षित mQDs साथ एक साथ imaged किया जा करने की अनुमति, orthogonal प्रजातियों के साथ उपलब्ध हैं. तस्वीर टैग के साथ लक्षित करने के अलावा, क्लिप टैग, हेलो टैग का उपयोग कर mQDs और biotinylated प्रोटीन के साथ लक्ष्य प्रोटीन की लेबलिंग भी सफल रहा था. इस प्रोटोकॉल इन mQDs साथ जीवित कोशिकाओं पर एक सतह रिसेप्टर की विशिष्ट लेबलिंग दर्शाता है, लेकिन प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न संदर्भों की एक संख्या के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
परिभाषित संयोजकता के साथ mQDs उत्पादन में महत्वपूर्ण पद्धति अंतर्दृष्टि है कि ~ 50 phosphorothioate से जुड़ेकुर्सियां QDs लपेट (और इस प्रकार एक साथ बंधन से दो अणुओं को रोकने) के लिए आवश्यक हैं. एक पाली ए एस 50 अनुक्रम reproducibly और stably जीवन टेक्नोलॉजीज से 605 एनएम QDs बंधे. इस उत्पाद को बंद किया गया है, steric बहिष्कार रणनीति विभिन्न आकार, आकार, वर्णक्रमीय गुणों वाले अन्य विक्रेताओं से इसी तरह के उत्पादों के लिए generalizable है.
ptDNA लिपटे QDs की दक्षता और स्थिरता QDs की सतह के रसायन शास्त्र और संरचना पर निर्भर करता है. इसलिए, एक प्रोटोकॉल की सफलता QDs की वाणिज्यिक स्रोत और रासायनिक संरचना पर निर्भर करेगा. इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, अंतर की तीन प्रमुख बिंदुओं QDs के विभिन्न व्यावसायिक स्रोतों के बीच मौजूद हैं: चरण हस्तांतरण के लिए आवश्यक शर्तों में एक अंतर; ptDNA द्वारा प्रारंभिक खूंटी thiol-ligand बाध्यकारी, संभवतः निरोधक विस्थापन की शक्ति में एक अंतर; और उजागर सीडीएसई कोर की राशि में एक अंतर है, जो कर सकते हैं Leएमपीईजी thiol चरण स्थानांतरण स्थितियों से QD का शमन करने के लिए विज्ञापन.
प्रकाशन के रूप में, mQDs के उत्पादन के लिए सबसे अच्छा संरचना के साथ QDs 545, 585, 605 और 625 एनएम (2A चित्रा) में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ जीवन टेक्नोलॉजीज से खरीदा 4-10 एनएम सीडीएसई / ZnS कोर / खोल QDs हैं. 'ज्वलंत' सूत्रीकरण (545, 605, आदि) पर आधारित QDs एमपीईजी thiol के अलावा पर बुझा लेते हैं और इस आवेदन के लिए उपयुक्त नहीं हैं. Aldrich और महासागर नैनोटेक से QDs अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन लंबे समय तक चरण हस्तांतरण कदम और trioctylphosphine ऑक्साइड के साथ pretreatment की आवश्यकता होती है. इस प्रोटोकॉल जीवन टेक्नोलॉजीज से QDs के लिए अनुकूलित किया गया है.
QDs रैप करने के लिए प्रयोग किया जाता पाली एक phosphorothioate अनुक्रम एक को लक्षित किनारा संकरण सकता है जो करने के लिए (ACTG) 5 के अनुक्रम युक्त एक देशी 20 मेर डीएनए पूंछ के साथ समाप्त होता है. इस क्रम में यह कोई माध्यमिक संरचना करने के लिए कुछ किया है, के रूप में सुविधाजनक है, और hybridiz रहेगापीबीएस में 37 डिग्री सेल्सियस पर एड. एक डीएनए सिंथेसाइज़र के लिए उपयोग नहीं है, ptDNA एक सी 8 कॉलम का उपयोग करके संश्लेषित और फिर रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा शुद्ध कर सकते हैं. ptDNA एक देशी रीढ़ के साथ बराबर oligonucleotides से HPLC पर बाद में elute जाएगा. आम तौर पर हम शुद्धि के बाद हमारे phosphorothioate oligonucleotides पर समूह की रक्षा DMT '5 छोड़ दें.
PtDNA लिपटे QDs की passivation आमतौर पर QDs की कोलाइडयन स्थिरता में सुधार और सबसे प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए बाध्यकारी पृष्ठभूमि को कम करने के लिए आवश्यक है. प्रोटोकॉल QDs passivate करने के लिए एक खूंटी परत का उपयोग करता है. Carboxy खूंटी अतिरिक्त खूंटी इकाइयों के साथ alkane thiol ((सीओ 2 एच) सीएच 2 ओ (सीएच 2 सीएच 2 हे) 12 सी 11 एच 23 एसएच, carboxy-PEG12 alkane thiol) काफी पृष्ठभूमि कम प्रदान करता रह गया खूंटे दोनों बड़े होते हैं, हालांकि, और आम तौर पर और अधिक महंगा है. carboxy खूंटी अलका के साथ लेपित mQDsपूर्वोत्तर thiol ligands ऐसे फॉस्फेट बफर Salines और संस्कृति मीडिया के रूप में शारीरिक बफ़र्स में अत्यधिक स्थिर रहे हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर mQDs की लंबी अवधि के भंडारण (> 8 महीने) कोई महत्वपूर्ण एकत्रीकरण या ptDNA टुकड़ी 11 दिखाया. प्रयोग के आधार पर, QDs की खूंटी passivation अकेले हमेशा पर्याप्त गैर विशिष्ट mQDs के बंधन को कम नहीं करता. यह 50% ~ द्वारा mQDs का स्पष्ट hydrodynamic त्रिज्या में वृद्धि करता है, हालांकि काफी हद तक उपयोग करने से पहले 20 मिनट के लिए 3% बीएसए युक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में कोशिकाओं और mQDs दोनों incubating, कोशिकाओं के लिए बाध्य गैर विशिष्ट कम कर देता है. 0.5% कैसिइन साथ passivation गैर विशिष्ट आगे भी बंधन कम कर देता है लेकिन यह बीएसए की तुलना में एक बड़ी हद तक स्पष्ट आकार बढ़ जाता है.
MQDs के पूरक एक डीएनए किनारा के 5 'अंत अलग biomolecules के एक नंबर के लक्ष्यीकरण सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. Covalently प्रोटीन को संशोधित करने के लिए उपलब्ध स्थापित तकनीकों का एक नंबर, एल कर रहे हैंipids और एकल असहाय डीएनए (ssDNA) के साथ शक्कर. SsDNA extracellularly प्रस्तुत किया जाता है, तब तक यह घुलनशील mQDs के लिए सुलभ है. ऊपर दृश्यों के साथ mQDs तेजी से सेल संस्कृति शर्तों के तहत उनके पूरक डीएनए किनारा साथ संकरण जाएगा. सेल की मोटी और नकारात्मक आरोप लगाया glycocalyx ऊपर बाध्यकारी अनुक्रम तरक्की के रूप में तो ptDNA और लक्षित कर अनुक्रम के बीच एक 10-20x पाली (सीटी) स्पेसर को लक्षित कुशल के लिए आवश्यक हो सकता है. इस प्रोटोकॉल के लिए हम दोनों mQDs संकरित और covalently तेजी से और विशिष्ट लेबलिंग के लिए एक तस्वीर टैग प्रोटीन को ही कड़ी होगी कि (CAGT) 5 के एक पूरक अनुक्रम के साथ एक बड़ी डीएनए का उत्पादन करने के लिए चुना है. अच्छी तरह से एमिनो संशोधित oligonucleotides को अन्य एनएचएस एस्टर युग्मन के लिए एक समान प्रोटोकॉल का कार्य करता है.
एकल अणु इमेजिंग के लिए, लेबलिंग की एक कम घनत्व आमतौर पर व्यक्तिगत अणुओं को हल करने के लिए आवश्यक है. Passivating एजेंट के साथ पीबीएस में ~ 0.5 एनएम के अंतिम mQD एकाग्रताएक अच्छा लक्ष्य है. हालांकि, इन उच्च dilutions कभी कभी के तहत लेबलिंग कोशिकाओं की में हुई. यदि ऐसा होता है लेबलिंग की एक इष्टतम घनत्व मनाया जाता है, जब तक अतिरिक्त mQD जोड़ा जा सकता है. 0.5 एनएम mQD लक्षित सेल के बेसल सतह पर 20 mQDs (4B चित्रा देखें) ~ की कुर्की में हुई है, जबकि तस्वीर में चिह्नित मानव Notch1 के मामले में,> 10 एनएम mQD की सांद्रता घने लेबलिंग कोशिकाओं का उत्पादन किया. MQDs साथ सेल लेबलिंग चढ़ाया कोशिकाओं के confluency की अत्यधिक निर्भर था. पीढ़ी मिला हुआ कोशिकाओं उनके बेसल सतहों पर लेबल नहीं है.
संक्षेप में, एक सरल विधि monovalent उत्पन्न करने के लिए और मॉड्यूलर QDs वर्णित किया गया था. लाइव U2OS कोशिकाओं पर पायदान रिसेप्टर इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन के रूप में इन mQDs, लाइव सेल इमेजिंग आवेदनों की विस्तृत श्रृंखला में उपयोगिता लगता है. MQDs की प्रयोज्यता इस विशेष मामले तक सीमित नहीं है, लेकिन संभावित ऐसे अन्य प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, और एंजाइमों के रूप में अन्य सेलुलर लक्ष्यों के लिए बढ़ाया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
डीओडी W81XWH-1023/10/01 (ZJG), सिस्टम के लिए UCSF केंद्र और सिंथेटिक बायोलॉजी (ZJG) से अनुदान P50 GM081879, एनआईएच 5R21EB015088-02 (YJ) और एनआईएच 1R21EB018044 (ZJG और YJ) द्वारा उपलब्ध कराए गए धन. डी एस मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम क्रॉस अनुशासनात्मक postdoc रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |