We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
生細胞上の単一分子のダイナミクスは、それらの生物学的機能に寄与する。単一分子蛍光イメージングは、細胞表面1,2,3上の単一分子のダイナミクスを研究するための一般的な手法です。しかし、これらの研究において、最も一般的に使用されるイメージングプローブは、いくつかの重要な欠点を有する。例えば、従来の有機色素および蛍光タンパク質は、典型的な生細胞イメージングの条件下で約10 5〜10 6光子の放出後に漂白、適度な明るさ、約10 5〜10 6 M -1 cm -1でを提供するが、光化学的に不安定である4,5。対照的に、半導体ナノ粒子、頻繁に呼び出される量子ドット(QD)は、10 6〜10 7 M -1 cm -1での範囲とphotobl前に10 7 -10 8放出された光子を超えること吸光係数で、かなり明るく、より安定である5 eaching。有機フルオロフォアの上QDの改善された明るさと光安定性が大幅に高速フレームレートで単一分子の観察を可能にし、上ではるかに長い6を軌道。
その利点と商業的利用にもかかわらず、いくつかの負債は、これらの強力な造影剤のために残っている。第一に、彼らは不十分目標と生体分子6の架橋をもたらし得る、原子価をターゲットに定義しました。第二に、彼らは一般的に、特定の混雑した細胞環境7への接近が制限され、大きな流体力学的サイズ(> 20 nm)を持っている。第三に、彼らは、モジュール7をターゲットに限られている。いくつかの戦略は、これらの問題8,9,10に対処しようとしましたが、一般的に実装するために専門的な知識や試薬を必要としている。
これらの問題に対処するために、本発明者らは最近、小さな価を調製するための「立体排除」戦略を報告し、そしてモジュラー量子ドット11。量子ドットは、単一の長いホスホロチオエートDNA(ptDNA)ポリマーで包まれている。 ptDNAは、表面露出Zn原子とptDNAポリマーのホスホロチオエート基の間の複数のZn-Sの相互作用を介してQDの表面に結合する。シングルバウンドポリマーは、立体的に静電著しく、粒子の全体的なサイズ(約2nm)を増加させることなく、ポリマーの追加的な同等物の結合を除外している。全ての試薬は、製品が高収率で形成され、市販されており、プロセスは、精製のための唯一の脱塩工程を必要とする。シングルptDNA(MQDS)ドメイン( 例えば 、ベンジルグアニン(BG)、ベンジルシトシン、またはハロゲン化アルキル)を標的とするベアリングの相補的DNA鎖に結合して包まれたら、ラベル、量子ドット。
これらの機能は、具体的には、遺伝的に、目的のタンパク質に融合されるSNAP、CLIP&HALOのような酵素タグにMQDSをターゲットにしています。これは合成のためのプロトコルです、ターゲティング、および立体排除によって生成MQDSの生細胞イメージング。
MQD設計のモジュール性は、実験的な柔軟性の度合いの増加を可能にする。例えば、MQDS各種の迅速複数の標的の同時イメージングを可能にする独特な色で製造することができる。一本鎖DNA標的配列は、タンパク質に糖12、脂質をMQDSを指揮し、13面ができます。酵素タグの数は、複数のターゲットが差をターゲットMQDSと同時に画像化することができるように、直交反応性を用意しています。 SNAPタグと標的化することに加えて、CLIPタグ、HALOタグを使用してMQDSおよびビオチン化タンパク質と標的タンパク質の標識化も成功した。このプロトコルは、これらのMQDSと生細胞上の表面受容体の特異的標識を示したが、プロトコルは簡単に別のコンテキストの数に適合させることができた。
定義された原子価でMQDSを製造する際に重要な方法論的な洞察が〜50ホスホロチオエート連結されていること塩基は量子ドットをラップ(したがって同時に結合する二つの分子を防ぐ)する必要があります。ポリ-S 50シーケンスは、再現可能かつ安定ライフテクノロジーズから605 nmの量子ドットを結合した。この製品は廃止されているが、立体排除戦略は異なるサイズ、形状、スペクトル特性を有する他のベンダーの同様の製品に一般化である。
ptDNA包装されたQDの効率および安定性は、QDの表面の化学的性質および構造に大きく依存する。そのため、プロトコルの成功は、量子ドットの商業的供給源や化学構造に依存する。このプロトコルの目的のために、差の三つの主要な点は、QDのさまざまな商業的供給源との間に存在する:相間移動のために必要な条件の違い;最初のPEG-チオールリガンドの強さの差はptDNAによる変位を妨げる可能性が、結合;露出したCdSeコアの量の差、どの缶ルのmPEGチオール相間移動条件下によるQDのクエンチング広告。
出版物のように、MQDSの生産のための最良の構造を持つQDは4-10 nmの545、585、605&625 nmの( 図2A)の発光スペクトルとライフテクノロジーズ社から購入したCdSe / ZnSのコア/シェル量子ドットである。 「ビビッド」製剤(545、605、 等 )に基づいて、量子ドットは、MPEGチオールの添加によりクエンチし、この用途には適していません。アルドリッチ·海洋ナノテクからのQDはうまく動作しますが、より長い相間移動工程およびトリオクチルホスフィンオキシドによる前処理を必要とする。このプロトコルは、ライフ·テクノロジーズからのQDに最適化されています。
量子ドットをラップするために使用されるポリホスホロチオエート配列が標的に鎖がハイブリダイズしうる先の(ACTG)5の配列を含む、ネイティブ20-merのDNAテールで終了します。このシーケンスは、それが二次構造をほとんど有して、便利で、hybridiz残るPBS中で37℃でエド。 DNA合成へのアクセスがある場合、ptDNAはC 8カラムを使用して合成し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により精製することができる。 ptDNAは、ネイティブ骨格と同等のオリゴヌクレオチドよりもHPLC上で、後に溶出する。私たちは通常、5 '、DMTは精製後に私たちのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド上の保護基を残す。
ptDNA包装された量子ドットの不動態化は、通常、量子ドットのコロイド安定性を向上させ、大部分の実験的なアプリケーションのためにバックグラウンド結合を減少させるために必要とされる。プロトコルは、量子ドットを不動態化するPEG-レイヤーを使用しています。より長いPEGは両方とも大きいけれども、追加のPEGユニットを有するカルボキシPEGアルカンチオール((CO 2 H)CH 2 O(CH 2 CH 2 O)12 C 11 H 23 SH は 、カルボキシ-PEG12アルカンチオール)は、有意に減少し、バックグラウンドを提供一般的に、より高価。カルボキシPEGアルカでコーティングMQDSねチオールリガンドは、例えば、リン酸緩衝食塩液および培養培地などの生理的緩衝液中で非常に安定している。 4℃でMQDSの長期保存(> 8ヶ月)の有意な凝集またはptDNA剥離11を示さなかった。実験によっては、単独のQDのPEGの不動態化は必ずしも十分MQDSの非特異的結合を減らすことはありません。それは〜50%MQDSの見かけの流体力学的半径を増大しても、実質的に、使用前に20分間、3%BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で細胞とMQDS両方をインキュベートすると、細胞への非特異的結合を減少させる。 0.5%のカゼイン不動態化はさらに、非特異的結合を減少させるが、それは、BSAよりも大きい程度には明らかにサイズが大きくなります。
MQDSに相補的なDNA鎖の5 '末端は、異なる生体分子の数の標的化可能にするために改変することができる。共有結合的にタンパク質を修飾するために利用可能確立された技術の数、lはあり一本鎖DNA(一本鎖DNA)とipids&糖類。一本鎖DNAが細胞外に提示されている限り、それは、可溶性MQDSにアクセス可能である。上記の配列とMQDSは急速に細胞培養条件下でその相補的DNA鎖とハイブリダイズする。セルの厚さであり、負に帯電した糖衣上記の結合配列を高めるようにptDNAとターゲティング配列との間10-20xポリ – (CT)スペーサーは、標的に効果的に行うために必要とされる場合がある。このプロトコルのために、私たちは両方のMQDSにハイブリダイズし、共有結合的に迅速かつ特異的標識のためにSNAP-タグタンパク質に自分自身をリンクします(CAGT)5の相補配列とBG-DNAを作製することにしました。よくアミノ修飾オリゴヌクレオチドに他のNHS-エステルを結合するための同様のプロトコル機能。
単一分子イメージングのための標識の低密度は、典型的には、個別の分子を解決するために必要とされる。不動態化剤を含むPBS中〜0.5nmの最終的なMQD濃度良好な標的である。しかし、これらの高希釈を、時には下で標識細胞をもたらした。この場合は、標識の最適密度が観察されるまで、追加のMQDを添加することができる。 0.5 nMのMQD( 図4B参照 )、標的細胞の基底面で〜20 MQDSの取り付けをもたらしたSNAP-タグ付きヒトNotch1の場合には、> 10 nMのMQDの濃度は、高密度のラベリング細胞を作り出した。 MQDSによる細胞標識はプレートされた細胞の密集度の非常に依存していた。過度にコンフルエント細胞は、その基底面にラベルを付けていない。
要約すると、一価およびモジュールのQDを生成する簡単な方法を説明した。これらMQDSライブU2OS細胞上のNotch受容体を画像化することによって実証されるように、生細胞イメージングの幅広い用途において有用性を見出す。 MQDSの適用は、この特定のケースに限定されるものではなく、潜在的に他のタンパク質、核酸、および酵素のような他の細胞標的のために拡張することができる。
The authors have nothing to disclose.
DOD W81XWH-1023年10月1日(ZJG)、システムおよび合成生物学のためのUCSFのセンター(ZJG)、NIH 5R21EB015088-02(YJ)およびNIH 1R21EB018044(ZJG&YJ)からの助成金のP50のGM081879提供された資金。 DSはヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムによる索引懲戒ポスドク研究フェローシップによってサポートされていました。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |