We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
Dynamikken av enkle molekyler på levende celler bidrar til deres biologiske funksjon. Enkelt molekyl fluorescens bildebehandling er en populær metode for å studere enkelt molekyl dynamikk på celleoverflaten 1,2,3. Men de mest brukte avbildningsfølere i disse studiene har flere viktige ulemper. For eksempel konvensjonelle organiske fargestoffer og fluorescerende proteiner gir moderat lysstyrke, ca 10 5 -10 6 M -1 cm -1, men er fotokjemisk ustabilt, bleking etter utslipp av ca 10 5 -10 6 fotoner under typiske levende celle bildeforhold 4,5. I kontrast, halvleder nanopartikler, ofte kalt kvanteprikker (QDS), er betydelig lysere og mer stabil, med ekstinksjonskoeffisienter i størrelsesorden 10 6 -10 7 M -1 cm -1 og over 10 7 -10 8 slippes ut fotoner før photobleaching fem. Den forbedrede lysstyrke og fotostabilitet av QDS enn organiske fluoroforene muliggjør observasjon av enkle molekyler til betydelig raskere bildefrekvens og over mye lengre baner seks.
Til tross for sine fordeler og kommersiell tilgjengelighet, flere forpliktelser forblir for disse kraftige bildebehandlings agenter. For det første har de dårlig definert målretting valens, noe som kan resultere i tverrbinding av målrettede biomolekyler 6. For det andre, de har generelt et stort hydrodynamisk størrelse (> 20 nm) som begrenser tilgjengeligheten til visse fylt cellulære miljøer 7. For det tredje har de begrenset målretting modularitet 7. Flere strategier har forsøkt å løse disse problemene 8,9,10, men generelt krever spesialisert kunnskap og reagenser å implementere.
For å løse disse problemene, vi nylig rapportert en "sterisk Utelukkelse" strategi for å forberede enverdige, liten, ogmodulære QDS 11. De QDS er pakket med en eneste lang fosfortioat DNA (ptDNA) polymer. Den ptDNA bindes til QD overflate gjennom flere Zn-S-interaksjoner mellom overflateeksponerte Zn-atomer og de Fosfortioat-grupper av den ptDNA polymer. En enkelt bundet polymer sterisk og elektrostatisk utelukker binding av flere ekvivalenter av polymer uten i vesentlig grad å øke partikkelens samlede størrelse (ca 2 nm). Alle reagenser er kommersielt tilgjengelige, produkter dannes i høyt utbytte, og prosessen krever bare avsaltingstrinn for rensing. Når merket, QDS innpakket med et enkelt ptDNA (mQDs) binder seg til komplementære DNA-trådene peiling rettet domener (f.eks benzylguanine (BG), benzylcytosine eller alkylhalides).
Disse funksjonene målrette mQDs spesifikt til enzymatiske koder som SNAP, CLIP & HALO som er genetisk smeltet til protein av interesse. Dette er en protokoll for syntese, Målretting, og live-cell imaging av mQDs produsert av sterisk eksklusjon.
Modulariteten MQD design gir en økt grad av eksperimentell fleksibilitet. For eksempel kan en rekke mQDs raskt fremstilt i unike farger som muliggjør den samtidige avbildning av flere mål. SsDNA målsøkende sekvens kan direkte mQDs til proteiner, sukker, lipider og 12 flater 13. En rekke enzymatiske koder er tilgjengelig med ortogonale reaktiviteter slik at flere mål som skal avbildes samtidig med ulikt målrettede mQDs. I tillegg til målretting med SNAP tag, merking av target proteiner med mQDs bruke Klipp tag, HALO tag, og biotinylerte proteiner var også vellykket. Denne protokollen demonstrerer spesifikk merking av en overflate-reseptor på levende celler med disse mQDs, men protokollen kan lett tilpasses til en rekke ulike sammenhenger.
Den betydelige metodiske innsikt i å produsere mQDs med definert valens er at ~ 50 fosfortioat bundetbaser er pålagt å vikle QDS (og dermed hindre at to molekyler fra binding samtidig). En poly-A S 50 sekvens reproduserbart og stabilt bundet 605 nm QDS fra Life Technologies. Selv om dette produktet er utgått, er den sterisk utelukkelse strategi generaliseres til lignende produkter fra andre leverandører har ulike størrelser, former, spektrale egenskaper.
Effektivitet og stabilitet ptDNA-innpakket QDS avhenger kritisk på overflatekjemi og struktur av QDS. Derfor vil lykkes i en protokoll avhenge av kommersiell kilde og kjemiske struktur av de QDS. Ved anvendelsen av denne protokollen, tre store poeng av forskjellen finnes mellom ulike kommersielle kilder QDS: en forskjell i forutsetninger for fase overføring; en forskjell i styrken av initial PEG-tiol-ligand binding, eventuelt hindrer forskyvning av ptDNA; og en forskjell i mengden av eksponert CdSe kjerne, som kan leannonsen til slukke av QD av MPEG tiol faseoverføringsforhold.
Som for offentliggjøring, QDS med den beste strukturen for produksjon av mQDs er 4-10 nm CdSe / ZnS kjerne / skall QDS kjøpt fra Life Technologies med utslipp spektra ved 545, 585, 605 og 625 nm (figur 2A). QDS basert på 'Vivid' formulering (545, 605, etc.) slukke ved tilsetning av mPEG tiol og er ikke egnet for dette programmet. QDS fra Aldrich og Ocean Nanotech fungerer bra, men krever lengre Phase Transfer trinn og forbehandling med trioktylfosfinoksyd. Denne protokollen er optimalisert for QDS fra Life Technologies.
Den poly-A fosfortioat-sekvens som brukes for å vikle den QDS er avsluttet med et opprinnelig 20-mer DNA-halen inneholdende sekvensen av (ACTG) 5 til hvilken en rettet tråd kan hybridisere. Denne sekvensen er praktisk, som det har liten eller ingen sekundærstruktur, og vil forbli hybridized ved 37 ° C i PBS. Hvis det er tilgang til en DNA-syntetisator, kan ptDNA ved syntetisert og deretter renset ved revers-fase høyytelses-væskekromatografi (HPLC) under anvendelse av en C 8 kolonne. Den ptDNA vil elueres senere på HPLC enn tilsvarende oligonukleotider med en innfødt ryggrad. Vi vanligvis forlate 5 'DMT-beskyttende gruppe på våre Fosfortioat oligonukleotider etter rensing.
Passivisering av ptDNA-innpakket QDS er vanligvis nødvendig for å forbedre kolloidalt stabilitet QDS og redusere bakgrunns bindende for de fleste eksperimentelle applikasjoner. Protokollen bruker en PEG-lag for å passivate QDS. Karboksy PEG alkantiol med ekstra PEG-enheter ((CO 2 H) CH2 O (CH2 CH2 O) 12 C 11 H 23 SH, karboksy-PEG12 alkantiol) gir betydelig redusert bakgrunn, skjønt de lengre tappene er både større, og generelt mer kostbare. mQDs belagt med karboksy PEG alkane tiol-ligander er meget stabil i fysiologiske buffere slik som fosfat-bufret salines og kulturmedier. Langtidslagring (> 8 måneder) av mQDs ved 4 ° C viste ingen signifikant aggregering eller ptDNA avløsning 11. Avhengig av eksperimentet, PEG passivering av de QDS alene ikke alltid er tilstrekkelig å redusere ikke-spesifikk binding av de mQDs. Inkubering av begge celler og mQDs i fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 3% BSA i 20 min før bruk i det vesentlige reduserer ikke-spesifikk binding til celler, selv om det øker den tilsynelatende hydrodynamisk radius av mQDs ved ~ 50%. Passive med 0,5% kasein reduserer ikke-spesifikk binding enda mer, men det øker den tilsynelatende størrelse til en større grad enn BSA.
Den 5 'ende av en DNA-tråd komplementær til mQDs kan bli modifisert for å muliggjøre målretting av et antall forskjellige biomolekyler. Det finnes en rekke etablerte teknikker tilgjengelig for kovalent å modifisere proteiner, lipids og sukkere med enkelt-trådet DNA (ssDNA). Så lenge ssDNA blir presentert ekstracellulært, er det tilgjengelig for oppløselige mQDs. mQDs med de ovennevnte sekvenser som hurtig vil hybridisere med deres komplementære DNA-tråd i henhold til cellekulturbetingelser. En 10-20x poly (CT) spacer mellom ptDNA og den målsøkende sekvens kan være nødvendig for effektiv målretting derved å heve bindende sekvens ovenfor den tykke og negativt ladet glycocalyx av cellen. For denne protokollen valgte vi å produsere en BG-DNA med en komplementær sekvens av (CAGT) 5 som vil både hybridisert til mQDs og kovalent knytte seg til en SNAP-tag protein for rask og spesifikk merking. En lignende protokoll fungerer godt for kobling andre NHS-estere til amino-modifisert oligonukleotider.
For enkelt-molekyl avbildning, er en lav tetthet av merking som vanligvis kreves for å løse de enkelte molekyler. En endelig MQD konsentrasjon av ~ 0,5 nM i PBS med passiviserende middeler et godt mål. Men disse høye fortynninger av og til resulterte i under-merking av cellene. Hvis dette skjer, kan ytterligere MQD legges inntil en optimal tetthet av merking er observert. I tilfelle av SNAP-tagget humant Notch1, konsentrasjoner på> 10 nM MQD produsert tette merking celler, mens 0,5 nM MQD resulterte i festingen av ~ 20 mQDs på den basale overflaten av målrettet celle (se figur 4B). Cell merking med mQDs var svært avhengig av konfluens av belagt celler. Altfor konfluente celler ikke merke på sine basale overflater.
I sammendraget, til en enkel metode generere mono og modul QDS ble beskrevet. Disse mQDs finne verktøyet i bredt spekter av levende celle bildebehandlingsprogrammer, som demonstrert av imaging Notch reseptor på levende U2OS celler. Anvendelse av mQDs er ikke begrenset til dette spesifikke tilfellet, men kan eventuelt utvides til andre cellulære mål, for eksempel andre proteiner, nukleinsyrer, og enzymer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra DOD W81XWH-10-1-1023 (ZJG), Grant P50 GM081879 fra UCSF Center for Systems og syntetisk biologi (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) og NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS ble støttet av Human Frontier Science Program Tverrfaglig postdoc stipendiat.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |