We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.
The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.
Dynamiken i enskilda molekyler på levande celler bidrar till deras biologiska funktion. Enda molekyl fluorescens avbildning är en populär metod för att studera enstaka molekyl dynamik på cellytan 1,2,3. Men de vanligaste avbildningssonder i dessa studier har flera viktiga nackdelar. Exempelvis konventionella organiska färgämnen och fluorescerande proteiner ger måttlig ljusstyrka, ca 10 5 -10 6 M -1 cm -1, men är fotokemiskt instabila, blekning efter utsläpp av cirka 10 5 -10 6 fotoner under typiska live-cell imaging villkor 4,5. Däremot halvledarnanopartiklar, ofta kallade kvantprickar (QDs), är betydligt ljusare och mer stabil, med extinktionskoefficienter i intervallet 10 6 -10 7 M -1 cm -1 och över 10 7 -10 8 utsända fotoner före photobleaching 5. Den förbättrade ljusstyrka och fotostabilitet av QDs över organiska fluoroforer möjliggör observation av enstaka molekyler till betydligt snabbare frame rates och över mycket längre banor 6.
Trots sina fördelar och kommersiell tillgänglighet, flera skulder kvarstår för dessa kraftfulla avbildningsmedel. För det första har de dåligt definierade inriktning valens, vilket kan resultera i tvärbindning av riktade biomolekyler 6. För det andra, de i allmänhet har en stor hydrodynamisk storlek (> 20 nm) som begränsar tillgängligheten till vissa trångt cellulära miljöer 7. För det tredje, de har begränsad inriktning modularitet 7. Flera strategier har försökt lösa dessa problem 8,9,10, men i allmänhet kräver specialiserad kunskap och reagenser att genomföra.
För att lösa dessa problem, som nyligen rapporterade vi en "Sterisk utestängning" strategi för att förbereda monovalent, små ochmodulära QDs 11. De QDs är lindade med en enda lång fosfortioat-DNA (ptDNA) polymer. Den ptDNA binder till QD ytan genom flera Zn-S interaktioner mellan ytexponerade Zn-atomer och fosfortioatbindningar grupper ptDNA polymeren. En enda bunden polymer steriskt och elektro utesluter bindning av ytterligare medel i polymeren utan att signifikant öka partikelns totala storlek (ca 2 nm). Alla reagenser är kommersiellt tillgängliga produkter bildas i högt utbyte, och processen kräver endast avsaltningssteg för rening. En gång märkt, QDs inslagna med en enda ptDNA (mQDs) binder till komplementära DNA-strängar som bär riktar domäner (t.ex. bensylguanin (BG), benzylcytosine eller alkylhalider).
Dessa funktioner rikta mQDs specifikt till enzymatiska taggar såsom SNAP, CLIP & HALO som är genetiskt smält till proteinet av intresse. Detta är ett protokoll för syntesen, Inriktning, och live-cell imaging av mQDs produceras av steriskt utanförskap.
Den modularitet MQD designen möjliggör en ökad grad av experimentell flexibilitet. Till exempel kan en mängd olika mQDs snabbt ställdes på unika färger som möjliggör för samtidig avbildning av multipla mål. The ssDNA målsekvens kan rikta mQDs till proteiner, sockerarter 12, lipider och ytor 13. Ett antal enzymatiska taggar finns med ortogonala reaktivitet, vilket gör att flera mål som ska avbildas samtidigt med differentiellt riktade mQDs. Förutom att rikta med SNAP tag, märkning av målproteiner med mQDs använder CLIP etikett, HALO tag, och biotinylerade proteiner var också framgångsrika. Detta protokoll visar den specifika märkningen av en ytreceptor på levande celler med dessa mQDs, men protokollet skulle lätt kunna anpassas till en rad olika sammanhang.
Den betydande metodologiska insikter i att producera mQDs med definierad valens är att ~ 50 fosfortioat bundenbaser måste linda QDs (och därigenom förhindra två molekyler från att binda samtidigt). En poly-A S 50 sekvens reproducerbart och stabilt bunden 605 nm QDs från Life Technologies. Även om denna produkt har upphört, är den steriska utanförskap strategin generaliserbar för liknande produkter från andra leverantörer som har olika storlekar, former, spektrala egenskaper.
Den effektivitet och stabilitet ptDNA-inslagna QDs beror kritiskt på ytkemi och struktur QDs. Därför kommer framgången av ett protokoll beror på kommersiell källa och kemisk struktur av QDs. I detta protokoll, tre stora meningsskiljaktigheter finns mellan olika kommersiella källor av QDs: en skillnad i nödvändiga för fasöverförings förhållanden; en skillnad i styrkan av initiala PEG-tiol-ligand-bindning, eventuellt hindrar förskjutning av ptDNA; och en skillnad i mängden exponerade CdSe kärna, som kan lead till släckning av QD av MPEG tiol fasöverföringsbetingelser.
Från och med publiceringen, QDs med den bästa strukturen för produktion av mQDs är 4-10 nm CdSe / ZnS core / shell QDs köpt från Life Technologies med emissionsspektra vid 545, 585, 605 och 625 nm (Figur 2A). QDs baserade på "Levande" formulering (545, 605, etc.) släcka vid tillsats av mPEG tiol och är inte lämpliga för denna tillämpning. QDs från Aldrich och Ocean Nanotech fungerar bra, men kräver längre fas överföringssteg och förbehandling med trioktylfosfinoxid. Detta protokoll har optimerats för QDs från Life Technologies.
Poly-A fosfortioat sekvens som används för att linda QDs avslutas med en infödd 20-mer DNA svans innehållande sekvensen av (ACTG) 5 till vilken en inriktning sträng kan hybridisera. Denna sekvens är bekvämt, eftersom det har liten eller ingen sekundär struktur, och kommer att förbli hybridized vid 37 ° C i PBS. Om det inte finns tillgång till en DNA-syntetiserare kan ptDNA genom syntetiserades och renades därefter genom omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med användning av en C-8-kolonn. Den ptDNA kommer eluera senare på HPLC än motsvarande oligonukleotider med en infödd ryggrad. Vi lämnar vanligtvis 5 "DMT skyddsgruppen på våra fosforotioatoligonukleotider efter rening.
Passive av ptDNA-inslagna QDs krävs vanligtvis för att förbättra kolloidal stabilitet QDs och reducera bakgrunds bindande för de flesta experimentella tillämpningar. Protokollet använder ett PEG-skikt för att passivera de QDs. Karboxi PEG alkan tiol med ytterligare PEG-enheter ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, karboxi-PEG12 alkan tiol) ger signifikant minskad bakgrund, även de längre PEG är både större, och i allmänhet dyrare. mQDs belagda med karboxi PEG alkane tiol ligander är mycket stabilt i fysiologiska buffertar såsom fosfat-buffrad saltlösningar och odlingsmedia. Långtidslagring (> 8 månader) för mQDs vid 4 ° C visade ingen signifikant aggregering eller ptDNA lossnar 11. Beroende på experimentet, PEG passivering av de QDs ensam inte alltid i tillräcklig utsträckning reducera icke-specifik bindning av de mQDs. Inkubation av både celler och mQDs i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 3% BSA under 20 min före användning väsentligen reducerar icke-specifik bindning till celler, men den gör det ökar den skenbara hydrodynamiska radien av de mQDs vid ~ 50%. Passivering med 0,5% kasein minskar den icke-specifika bindningen ännu längre men det ökar den skenbara storleken till en större utsträckning än BSA.
5'-änden av en DNA-sträng som är komplementär till de mQDs kan modifieras för att möjliggöra inriktning av ett antal olika biomolekyler. Det finns ett antal etablerade tekniker tillgängliga för att kovalent modifiera proteiner, lipids & socker med enkelsträngat DNA (ssDNA). Så länge som ssDNA presenteras extracellulärt, är den tillgänglig för lösliga mQDs. mQDs med ovanstående sekvenser kommer snabbt hybridisera med deras komplementära DNA-strängen i cellodlingsförhållanden. En 10-20x poly (CT) spacer mellan ptDNA och den målsökande sekvensen kan krävas för effektiv inriktning, så att höja bindningssekvensen ovanför den tjocka och negativt laddade glykokalyx av cellen. För detta protokoll valde vi att producera en BG-DNA med en komplementär sekvens av (CAGT) 5 som både hybridiserade till mQDs och kovalent länka sig till en SNAP-tagg protein för snabb och specifik märkning. Ett liknande protokoll fungerar väl för koppling av andra NHS-estrar till aminomodifierade oligonukleotider.
För enkel-molekyl avbildning, är en låg densitet av märkning som typiskt krävs för att lösa enskilda molekyler. En slutlig MQD koncentration av ~ 0,5 nM i PBS med passiveringsmedletär ett bra mål. Men ibland lett till under märkning av cellerna dessa höga utspädningar. Om detta inträffar kan ytterligare MQD sättas tills en optimal densitet av märkning observeras. I fallet med SNAP-tagged human Notch1, koncentrationer av> 10 nM MQD produceras täta märkningsceller medan 0,5 nM MQD resulterade i vidhäftning av ~ 20 mQDs vid den basala ytan av målcellen (se figur 4B). Cell märkning med mQDs var starkt beroende av sammanflyt av pläterade celler. Alltför sammanflytande celler inte märka på sina basala ytor.
I sammanfattning, att en enkel metod generera monovalenta och modulära QDs beskrevs. Dessa mQDs finna användbarhet inom brett spektrum av levande cellavbildningstillämpningar, såsom visas genom avbildning av Notch-receptorn på levande U2OS celler. Tillämpligheten av mQDs är inte begränsad till detta specifika fall, men kan potentiellt utvidgats till andra cellulära mål, såsom andra proteiner, nukleinsyror och enzymer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering från DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), bidrag P50 GM081879 från UCSF Centrum för Systems och Syntetisk biologi (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) och NIH 1R21EB018044 (ZJG & YJ). DS stöddes av Human Frontier Science Program tvärvetenskaplig postdoc forskningsgemenskap.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
mQD Production: | |||
Phosphorothioate DNA: | |||
(A*)x50-(ACTG)x5 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
Quantum Dots: | |||
QDots 525, 585, 605 & 625 | Invitrogen | Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605) | Custom QD synthesis for QD625. |
QD610 | Ocean Nanotech | QSP-610-10 | |
QD 610 lamda | Aldrich | 731854 | |
Chloroform, 99.8% | ACROS | 67-66-3 | |
Tetrabutylammonium bromide, 98.0% | Sigma-Aldrich | 426288 | |
mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95% | Polypure | 11156-0695 | |
HSC11EG6CO2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H] | ProChimia | TH 003-m11.n6-0.1 | |
Boric Acid, 99.5% | Sigma-Aldrich | B0394 | |
Sodium Hydroxide, 99.0% | ACROS | S/4845 | |
Sodium Chloride, 98% | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Agarose LE | U.S. Biotech Sources | G02PD-125 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459828 | |
BG-DNA Production: | |||
Amine DNA: | |||
(CAGT)5-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
(CAGT)5(T)40-NH2 | IDT | N/A | Most DNA Synthesis companies |
NHS-GLA-Benzylguanine | New England Biosciences | S9151 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8428 | |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | 83264 | |
NAP5 Column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
C18 Column | |||
Acetonitrile | |||
Mammalian Cell Culture & Imaging: | |||
Cell line expressing SNAP-tagged protein | New England Biosciences | E9100S | |
McCoys 5A | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
Fetal Bovine Serum | UCSF Cell Culture Facility (?) | Specific to U2OS culture | |
PBS | UCSF Cell Culture Facility (?) | ||
Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass | Thermo-Fischer Scientific | 155409 | |
Matriplate 96-well plate | Brooks Life Science Systems | MGB096-1-2-LG-L | |
BSA | |||
5% Alkali-soluble Casein | EMD Millipore | 70955 | Not all caseins are the same |
(Optional) DNA Synthesis Reagents: | |||
5’ Amine modifier C6 | Glen Research | Oct-06 | |
dA-Thiophosphoramidite | Glen Research | 10-700 | |
Analysis Software: | |||
FIJI | http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/ | ||
RyTrack.pro | http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html | ||
Tracker | http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software |