顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em>インビトロ</em

Summary

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Abstract

Granulocytes play a key role in the body’s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Introduction

顆粒球は抗原の侵入に対する防御の第一線を提供し、体の自然免疫系の一つの成分を表している。顆粒球機能を評価するための従来の方法は、それが困難な顆粒^1-4を変更したかをまとめて把握すること、別個の方法を使用して、食作用能力または酸化的バーストに焦点を当てた。流れの分野における進歩は、フローサイトメトリーのハイスループット様式⁵のセルの高解像度、マルチカラー撮像が可能な卓上型機器の生産をもたらした。従来のフローサイトメトリーでイメージングを組み合わせる能力は、既存のフローサイトメトリー法内革新および免疫系に関する新しい情報を抽出するために必要な技術的プラットフォームを提供進歩を表す。

過去10年間で、私たちの研究室では、特に、鋭く、様々な栄養と運動療法パットの効果が注目されている先天性の免疫機能^6-9でRNS。この原稿で実証方法は、臨床免疫学の分野内で実用的な意味を持っている。本発明の方法は、同時に細菌粒子と酸化的バーストの食作用を測定するための画像ベースのフローサイトメトリーのパワーを活用しています。このアプローチを用いて、分析の画像ベースの部分で提供さ変数を使用して活性化顆粒球を分離することができる。これらのサブセットは、個々の顆粒球上の細胞の画像を評価するた後だけに識別可能であった。さらに、アッセイのインキュベーション時間は3活性化サブセット¹⁰との間の遷移に影響を与えた。これにより、複数のインキュベーション時間の使用は、特定の実験的治療後の顆粒球機能の変化を試験するための方法を可能にすることができることはもっともらしい。本稿の目的は、同時にoxidatで食作用を測定するために画像ベースのフローサイトメトリーを用いて顆粒球機能を評価する方法を実証することであったIVEはバースト。

Protocol

注：このメソッドに記述されているすべての血液採取手順はヘルシンキ宣言に従って行われ、被験者のためのUNT治験審査委員会（IRB）により承認された。すべての被験者は正常な体重、彼らは明らかに健康であることを確実にするために、本発明の方法で使用された血液採取のための書面による同意を与えた、と無病。 1.試薬ソース＆準備使用CD66b-APC（クローン＃のG10F5、DF = 1：50）とCD45-APCeFluor780（クローン＃2D1; = 1 DF：50）このアッセイのために。 注：前に研究するために、CD45とCD66b抗体は、他の白血球から最適希釈はっきり解決顆粒球（CD45 + / 66B +）を決定するために、力価測定した（CD45 + / 66b-）11。染色するための希釈した抗体を添加すると、チューブの最終希釈は875だった。 株式Sを購入し、解凍pHrodo赤い色素で標識された黄色ブドウ球菌生体粒子。 1mの濃度でサスペンド滅菌PBSで1ml当たり生体粒子のグラム。アリコートをアッセイに使用するまで-20℃で凍結生体粒子及びストアを希釈する。 ジヒドロエチジウム（DHE）を溶解し、10グラム/ mlの最終濃度までDMSOに、酸素フリーラジカル（ すなわち、酸化的バースト）の存在下で蛍光エチジウムブロマイドに変換される。 それぞれが200mg / mlおよび17.5ミリグラム/ミリリットルの2段階希釈液の無菌PBSと混合（指定されたアッセイのインキュベーション期間は、次の追加の食作用を防止するために使用される）、N-エチルマレイミド。アッセイでは、15 mMの最終濃度を使用する。 N-エチルマレイミドを解凍する際のN-エチルマレイミドを溶液中に残存しないように、37℃のヒートブロックを使用する。 最後の固定工程の後、核DNAを染色するために7AADを使用しています。添加の前に、滅菌PBSで株式7AAD 1:10に希釈する。 2.血液サンプル採取 O / N速い（>炉冷し）とabstenti以下の研究室に到着する科目を掲載身体活動（> 12時間）から上に。 アルコール準備パッドで皮膚を洗浄後、末梢腕静脈に無菌の採血針を挿入します。 市販のヘパリンナトリウムで満たされている避難チューブに血液を収集します。 収集後、被験者の腕に接着剤包帯を適用します。 10回を混合するために、血液チューブを反転してから分析までロッカーに置きます。 3.食作用アッセイ法解凍黄色ブドウ球菌の生体粒子（RT）、DHE（RT）、及びN-エチルマレイミド（37°C）。 無菌フードでの作業中に4個々の1.2ミリリットルチューブに黄色ブドウ球菌の生体粒子の20 Lを追加します。 生体粒子を含む各チューブにDHEの40 Lを追加します。 静かにチューブの底に試薬を収集するためにベンチ表面にチューブをタップします。 生体粒子とDHEで充填されている各チューブに混合の全血100 Lを追加します。 すべての汚染血液を除去するために綿先端アプリケーターで、チューブの内側の端を拭きます。 血液添加後3サイクルのための血液と試薬を混合するために設定された電子ピペットを用いて血液と試薬を混ぜる。 アイスバケットでアッセイチューブを配置し、光から保護するためにカバーしています。 10、20、および40分間のアッセイチューブをインキュベートする。すべてのアッセイチューブが同時に完了を保証するために40分間の管で始まる。 37°Cビード浴中で解凍N-エチルマレイミド。 ピペットで各アッセイチューブに（1.4で上述）N-エチルマレイミドの15リットル、30分インキュベートする。 ピペットCD66b-APCの10 LおよびCD45-APCeFluor780（1.1において上述）で希釈した抗体の10 Lは、60分間インキュベートする。 ピペットで各アッセイチューブにWBC修正/ RBCの溶解液を750 Lは、60分間インキュベートする。 遠心分離機細胞ペレットを収集するためのアッセイチューブ（400×gで10分）。 真空が残留FLを残して、WBC溶解/ RBCの定着液を吸引細胞ペレットを上記のuid体積（100L）。 ピペット（1.5において上述した）希釈7AAD溶液10 Lと50 LのPBSを各アッセイチューブに。 冷蔵庫で1箔でアッセイチューブ、ラップチューブ上のキャリブレーションビーズ（〜25 L）各アッセイチューブに、場所キャップの低下、および場所を追加します。 サイトメーター画像ベースのフローにサンプルチューブをロードし、事前定義されたパラメータを使用して3000顆粒球イベントの最小収集：オートサンプラー、青（488 nmの、60ミリワット）、赤（640 nmの; 100 NW）、SSC（785 nmのを。 8.5 mW）とレーザー（ 図1）。 図1.取得方法＆テンプレート。サンプルは、画像ベースのフローサイトメーター（A）で得た。買収時には、CD66b-APC対明視野アスペクト比のドットプロットを使う、スパイク、キャリブレーションビーズから分離顆粒球に生成されたG INSPIRE V。100.2.292.0ソフトウェア（B）。赤、（640ナノメートル; 100 NW）、SSC（785ナノメートル、8.5ミリワット）レーザ、5000顆粒球の最小値は青オートサンプラー、（60 mWの488 nm）を使用して、各サンプルについて、取得した。ヒストグラムの数は、レーザーの設定とデータの他の側面収集を監視するために取得中に存在していることに注意してください。これらのヒストグラムはすべてオプションと実験室の標準的な操作手順は、品質管理として、それらを必要とする場合にのみ必要である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 4.サンプル収集と分析生の画像ファイル（RIF）に補償行列を適用し、画像化されたファイル（CIF）を補う作成するIDEASソフトウェアの自動ソフトウェア補償ウィザードを使用してください。 IDEASソフトウェアで個々のCIFファイルをロードし、顆粒球サブセットを識別するために、次のプロットを生成します。 </LI> 明視野勾配RMS（ 図2A）のヒストグラムを用いて、焦点にあるとみなされた細胞を同定するための最初のゲートを確立する。参照標準として非刺激対照を使用して、各患者試料について、この決定を行う。 明視野のアスペクト比（幅対セルの高さの比）対明視野領域（ 図2B）のドットプロットを使用して、破片およびダブレットから独立した一細胞に二次プロットを使用する。参照標準として非刺激対照を使用して、各患者試料について、この決定を行う。 細胞のきれいな集団が同定されたら、積極的に顆粒球（CD45 + / 66bが+）を識別するCD66b対CD45（ 図2C）のドットプロットを確立する。 S.のための明るいディテール強度の娘プロット（ 図3）を作成します活性化顆粒球のサブセットを識別するために、対酸化的バースト（DHE、y軸）のために明るい詳細強度球菌 （x軸）。 BRを収集チャンネル1と9のIGHTフィールド画像、チャンネル2で生体粒子、DHEチャンネル4で、7AADチャンネル5で、CD66bチャンネル11、およびCD45で12チャンネルで。 図2.分析テンプレート。この図は、焦点（A）であった細胞を同定するために生成された一連のプロット、単一細胞（B）、顆粒球（C）。追加のプロットは活性化顆粒球対非アクティブな顆粒球の3つのサブセットを同定するために使用した。取得した画像ファイルはすべて分析はアイデアV.6ソフトウェアを使用して完成させた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Representative Results

画像ベースのフローサイトメトリーを使用すると、我々は、3つの異なる活性化サブセット（ 図3）への活性化顆粒球の均一な集団を分離させた。この方法では、最も効果的な方法は、3活性化サブセットを酸化的バースト対（ 黄色ブドウ球菌 ）（DHE）（;図4図3）食作用のために明るいディテール強度をプロットしている解決します。また、IDEASソフトウェアの共局在ウィザードを使用することは非常に活性化顆粒球の特徴的な兆候である、同時食作用および酸化的バーストの存在の定量化を可能にする。 活性化顆粒球サブセットの図3の同定は、細胞表面マーカー（CD45 + / 66bが+）を用いて顆粒球の同定後、娘プロットは明るい細部INTENで生成された酸化的バーストのための明るいディテール強度対食作用のためにsity。このアプローチは、中程度のアクティブ、非アクティブ（紫）、ローアクティブ（赤、A）、（青、B）の割合は、高活性な（黄色、C）顆粒を使用することを決定した。このゲーティング技術は、種々の活性化顆粒球サブセットの相対的な存在量に関するアッセイインキュベーション時間の効果を評価するために使用した。 「ハイアクティブ」顆粒球の割合が最も高いが、40分間インキュベーション後に存在していた。取得した画像ファイルはすべて分析はアイデアV.6ソフトウェアを使用して完成させた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 活性化顆粒球の三つの異なるサブセットの存在を示すことに加えて、それは、アッセイインキュベーション時間は、各活性化顆粒球サブセットの相対量に影響を与えたことが実証された。具体的には、40分株式会社ubationは「高アクティブ」顆粒球の最大の割合をもたらした。少なくとも三つのアッセイインキュベーション期間を含めることによって、所与の臨床治療が、顆粒球の一時的な活性化状態を変化させる方法を決定することも可能である。これは、食作用および酸化的バーストの同時測定の関数として、異なる活性化顆粒球のサブセットを識別するために画像ベースのフローサイトメトリーを使用して最初の公表された方法である。 細胞マーカーの図4の代表的な画像は 、ハイアクティブ（A）として分類された細胞の画像ギャラリー、適度な活性（B）、及び、ローアクティブ（C）は、この図に示されている。 黄色ブドウ球菌の生体粒子はCH03である、酸化的バーストは、CD66bはである、側方散乱がCH06である、核のための7AADがCh05である、CH04であるCH11、およびCD45はのCh12である。また、酸化的バースト（CH04）対食作用（CH03）の共局在マージ画像が表示される。マージ画像で黄色のエリアその食作用および酸化的バーストを示すが同時に同じ解剖学的空間で発生している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

本発明の方法は^{、1,3,4,12-14}フローサイトメトリーを用いて顆粒球機能の評価のための既存の方法の改良を表す。このアッセイの重要なステップは、生体粒子およびDHEと血液試料の適切な混合に関連する傾向がある。不完全な混合は不正確な結果になります。完全な混合が重要である一方、混合方法は、自然の中で穏やかにする必要があります。これは、混合は、混合機能を備えた電子ピペットはなく、ボルテックスミキサーを使用して達成することが示唆された。アッセイにおけるもう一つの重要なステップは、常にアッセイチューブの上半分を汚染全く血がないことを確認することです。この残留血液を、滅菌綿棒を用いて除去することができる。そうする障害は、未溶解した赤血球と最終アッセイ調製物を汚染する可能性があるため、完全に除去することが重要である。

適切な補償制御が種をコントロールするために添加されるべきで、この方法を使用する前に顆粒球機能の様々な態様を特定するために使用される試薬の間でectral重複。この方法では、補償制御は、40分間のアッセイインキュベーションを示唆し、1つのマーカー（ すなわち、大腸菌 、DHE、など）で標識化された血液サンプルを採取することを含む。標識後、単一の正のイベントが収集され、補償行列は、IDEAS解析ソフトウェアで自動化されたウィザードを使用して生成される。これは、このアッセイが使用される場合、適切な補償制御が適切なアッセイ性能を確保するために完了していることが重要である。

分析は、明るいディテール強度が集団を分離するための最良の変数であることを特定し、また多くの重複が酸化的バーストおよび食作用信号の間に存在しているかを識別するための機能ファインダーと共局在のウィザードを使用して達成される。具体的には、画像ベースのフローサイトメトリーの使用は、3つのサブセットに活性化顆粒球を分離する能力を提供した。 T彼のサブセット破壊は酸化的バースト対食作用の明るい細部の強度を用いて決定した。これらの特異な細胞機能を調べることに加えて、同じ解剖学的位置（共局在）で同時に両方のイベントを示した細胞が同定された。 「高活性な」サブセットに落ちた顆粒球は食作用および酸化的バーストの間で一貫性の共局在を示した唯一の表現型であった。活性化した顆粒球サブセットのこの識別は、トラブルシューティングが必要とされる最大の領域です。新しいユーザがIDEASのサンプルプロセスワークフローを理解するために時間がかかるし、撮像コンポーネントを使用して細胞集団をゲーティングの仕組みを理解することが非常に重要である。ユーザーが作るために求めることができる他の修飾には、代替または追加のアッセイインキュベーション時間の選択を含む。現在の方法は、10〜40分の持続時間の使用を示唆している。しかしながら、この方法は、実験モデルに応じて使用するには、より長い検定期間を選択することが必要であり得る。このような改変は、個別に評価する必要があろう。

さらに、それは、アッセイのインキュベーション期間は3活性化サブセットの外観に大きな影響を与えることが判明した。この報告書に記載されたアプローチは、以前顆粒球機能^3,4,13,15に関して得ることができるどのような情報の拡張を表します。他の研究室は、免疫および疾患^15-17の包括的評価の一部として、顆粒球機能の変化を評価することの重要性を実証した。このアッセイの可能性にもかかわらず、それには限界がないわけではない。主な制限の一つは、高いサンプルスループット処理に伴うコストと時間の需要である。研究デザインは、特定の日に多数のサンプルを必要とするとき、これらは加工が困難であることができる。処理は、電子ピペットとディスペンサーを使用することによって合理化され、これらは高価になる傾向があり、あらゆる実験室で必ずしも利用できない。

研究の私たちの地域は、運動と食生活は免疫系の健康と機能^{6,8-10,18-20に}どのように影響するかの研究に焦点を当てています。このような目的は、人間の健康の様々な分野のための重要な実用的な意味を持っている。貪食機能のモニタリングが治療成績に重要となる運動と栄養効果の研究を超えて、この原稿で実証食作用方法は、臨床免疫学の他の分野で有用である可能性があります。本発明のアッセイは、潜在的に免疫学的アッセイは、イメージベースのフローサイトメーターからCANことができますユニークな撮影情報の利点を取ることによって、再発明されていることを多くのの最初のものです。

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Vacutainers	BD Life Sciences		used for blood collection
WBC Fixative / RBC Lysis solution	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	clone G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	clone 2D1
s.aureus bioparticles	Life Technologies	A10010
dihydroethidium	Sigma-Aldrich	D7008
N-ethylmalemide	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipore
Hematology Analyzer	Mindray	BC-3200
96-channel pipet	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Incubator	LabArmour	BeadBath
Imaging Flow Cytometer	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE Software	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Software	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Piercable Plate Sealer	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Workstation	Dell Computers	Various	Used for IDEAS analysis