Specificitet Analyse af protein lysin methyltransferaser Brug SPOT Peptide Arrays
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Lysin methylering er en ny post-translation modificering, og det er blevet identificeret på adskillige histon og ikke-histon-proteiner, hvor det spiller afgørende roller i celleudvikling og mange sygdomme. Ca. blev identificeret 5.000 lysin methylering sites på forskellige proteiner, som fremgår af få snesevis af protein lysin methyltransferaser. Dette antyder, at hver PKMT methylerer multiple proteiner imidlertid indtil nu kun én eller to substrater er blevet identificeret for flere af disse enzymer. For at nærme sig dette problem, har vi indført peptid-array baseret substratspecificitet analyser af PKMTs. Peptid arrays er effektive værktøjer til at karakterisere specificiteten af PKMTs fordi methylering af flere substrater med forskellige sekvenser kan testes på en array. Vi syntetiserede peptid arrays på cellulosemembran ved hjælp af en Intavis SPOT synthesizer og analyseret specificitet forskellige PKMTs. Baseret på resultaterne, flere af disse enzymer, roman substrates kunne identificeres. For eksempel, for NSD1 ved anvendelse af peptid-arrays, viste vi, at det methylerer K44 af H4 i stedet for den rapporterede H4K20 og desuden H1.5K168 er meget foretrukket substrat over tidligere kendte H3K36. Derfor peptid arrays er stærke værktøjer til biokemisk kendetegner PKMTs.
Introduction
I de sidste to årtier, flere rapporter vist betydningen af post-translationelle modifikationer (PTM) i cellulær udvikling og flere sygdomme som kræft, men for nylig protein lysin methylering er opstået som en anden vigtig PTM. Mens oprindeligt histon-lysin methylering viste sig at være en væsentlig kromatin mærke, senere arbejde viste også lysin methylering af flere ikke-histon proteiner 1-4. Den sekventielle overførsel af methylgrupper fra S-adenosyl-L-methionin til ε-aminogruppen i lysinrester katalyseres af en familie af enzymer kaldet Protein Lysin methyltransferaser (PKMTs), som indeholder mere end 60 proteiner i det humane genom. PKMTs blev oprindeligt opdaget som histon modificerende enzymer, der methylere specifik lysinrest men senere rapporter vist, at de også kunne methylere ikke-histon proteiner 5. Indtil nu blev identificeret ca. 5.000 lysin methylering sites på forskellige proteiner 6 </sop>, men de enzymer, der er ansvarlige for disse ændringer er ofte ikke identificeres. En årsag til dette er, at specificiteten af de fleste PKMTs ikke blevet undersøgt grundigt. Derfor er det gentagne forekommer at nye substrater af PKMTs opdages. Manglen på en detaljeret viden om substratspecificiteten af PKMTs hindrer forståelse af deres biologiske funktion og rolle. For at undersøge specificiteten af en PKMT i detaljer, skal måles og sammenlignes, som er ideelt gjort anvendelse af peptid arrays af methylering satser mange peptidsubstrater, der afviger i en eller få aminosyrer. Baseret på de resulterende specificitet profiler, kan identificeres potentielle substrater af PKMTs som yderligere kan studeres.
Peptid arrays er udbredte værktøjer til biokemisk analyse af antistoffer, peptid-modificerende enzymer og kortlægning af protein-protein-interaktion sites (antistof-antigen, en receptor-ligand) 7-9. Adskillige hundreder af peptider er nødvendige for SUCh applikationer. Forskellige metoder er til rådighed til peptidsyntese, blandt dem peptidsyntese på harpiks er meget almindeligt anvendt, men den har begrænsninger i gennemløb og det er relativt dyrt. Disse problemer blev løst med indførelsen af SPOT syntese metoden af Frank og kolleger 10. SPOT syntesemetode tillader syntese af flere hundrede peptider parallelt og i gennemsnit er billig i forhold til resin-syntese. Peptiderne syntetiseret på cellulose membran kan anvendes enten direkte til forskellige anvendelser eller peptider kan spaltes fra membranen og anvendes som frie peptider i opløsning assays eller til at forberede peptid microarrays 10-13.
SPOT syntese er en variant af fastfasepeptidsyntese, som bruger en cellulosemembran som en fast støtte og anvender standard Fmoc-kemi 10-13. Derfor er syntesen af peptidkæder begynder ved den C-terminale ende og fortsætter i retning afden N-terminale ende i modsætning til den biologiske syntese i ribosomer. Cellulosemembraner funktionaliseres til fastgørelse af den første aktiverede aminosyrer (Fig. 1). SPOT Metoden er baseret på den sekventielle levering af aktiverede aminosyrer i en dråbe opløsningsmiddel definerede pletter på membranen under anvendelse af et automatiseret pipetteringssystem. Den lille dråbe af væske dispenseres på den porøse membran, hvor den danner en cirkulær våd plet, som senere fungerer som en åben reaktor til de kemiske reaktioner i peptidsyntese. Pletstørrelsen bestemmes af det dispenserede volumen og den absorberende kapacitet af membranen er multipla af sådanne pletter arrangeret som arrays. Omfanget af syntese korrelerer med punktstørrelse og lasteevne membranen. Afstanden mellem pletter og tætheden af arrays styres ved at variere pletstørrelser. Cellulosemembran har flere fordele som fast fase i peptidsyntese, det er billigt, tolerant for chemicals der anvendes i peptidsyntese, stabile i vandige opløsninger og let at håndtere. Desuden sin hydrofile natur gør det egnet til en række biologiske assaysystemer. SPOT syntese kan udføres manuelt eller automatiseret (for 1000'erne af peptider), afhængigt af det nødvendige antal af peptider. En fuldautomatisk SPOT synthesizer fra Intavis (Köln, Tyskland) anvendes til vores applikationer. Den tillader syntese af peptider i forskellige mængder og med forskellig længde. Lineære peptider regelmæssigt syntetiseret med 15 til 20 aminosyre længde, foruden peptider op til 42 aminosyrer kan også fremstilles ved trinvis syntese 14,15. Men forøgelse af antallet af aminosyrer fører til reduktion i de samlede koblingsudbytter, hvilket påvirker kvaliteten af peptiderne. På grund af den lille mængde af peptider pr stedet, produkterne er ofte vanskeligt at oprense og kvaliteten af individuelle peptider ikke let kan vurderes. Derfor opnåede resultater fra SPOT PeptIDE arrays skal bekræftes enten peptider syntetiseret ved standardmetoder i større målestok, som kan oprenses og analyseres i henhold til standarderne i peptidsyntese eller ved at syntetisere proteiner indeholdende de ønskede peptidsekvenser. Alligevel fandt vi SPOT syntese at være meget pålidelig og resultater generelt at de kan gentages. SPOT syntese er ikke begrænset til proteinogene aminosyrer, flere kommercielt tilgængelige modificerede aminosyrer kan også anvendes til syntese, giver peptider ændres før og efter den endelige spaltning af sidekædebeskyttelse gruppe og desuden også tillader inkorporering af phosphorylerede, methylerede eller acetylerede aminosyrer 11.
Immobiliserede peptidbiblioteker syntetiseret ved SPOT metode kan anvendes direkte til mange biologiske og biokemiske assays. Vi anvendte peptid arrays omfatter 300-400 peptider for at undersøge substrat specificitet PKMTs. For enzymatisk modifikation, peptid-arrays inkuberet med de respektive PKMT og mærket [methyl-3H] -AdoMet i en passende buffer. Methylering af det respektive substrat analyseres ved at følge den enzymatiske overførsel af radioaktivt mærkede methylgrupper fra AdoMet til peptidsubstratet via autoradiografi (Fig. 3). Ved denne procedure peptidet arrays tillader undersøgelse af methylering af forskellige peptidsubstrater samtidig. En vigtig fordel ved denne fremgangsmåde er, at alle peptiderne er methyleret i konkurrence, således at i den lineære fase af methylering kinetik relative methylering af hvert peptid er proportional med den katalytiske hastighedskonstant divideret med dissociationskonstanten (kcat / K D) af enzymet til det respektive peptidsubstrat. Derfor er mængden af radioaktivitet inkorporeret i hver plet direkte korreleret med den enzymatiske aktivitet mod det særlige peptid. Brug afresultater af et peptid-array methylering eksperiment, kan specificitet profil PKMT defineres og baseres på denne roman substrater kan forjættede. Peptid arrays tillade hurtig og omkostningseffektiv validering af methylering af hidtil ukendte substrater på peptidet niveau. Til dette, er arrays forberedt som indeholder de forudsagte nye substrater sammen med modificerede peptider indeholdende en Ala i stedet for Lys på mål-sites samt positive og negative kontroller peptider. Endelig kan de hidtil ukendte substrater fremstilles som proteiner sammen med mutanter, i hvilken målet Lys ændres til Ala og methylering kan blive bekræftet på proteinniveau. Afhængigt af resultaterne er denne efterfølges af biologiske undersøgelser vedrørende mulige roller methylering af de nyligt beskrevne proteinsubstrater.
Protocol
Representative Results
Discussion
SPOT syntese som beskrevet her er en kraftfuld metode til at kortlægge protein-protein-interaktion steder og undersøge substratet anerkendelse af peptid-modificerende enzymer. Men SPOT syntese stadig har visse ulemper, fordi selv om peptiderne syntetiseret ved SPOT metode rapporteres at have mere end 90% renhed 21 Dette er vanskeligt at bekræfte i hvert tilfælde. Derfor resultater skal gengives ved andre metoder for eksempel ved anvendelse proteindomæner eller med oprensede peptider syntetiseret ved stan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. 화학. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
