SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
リジンのメチル化は、新たな翻訳後修飾であり、それは細胞の発達および多くの疾患において重要な役割を果たしているいくつかのヒストンおよび非ヒストンタンパク質、上で同定された。約5000リジンメチル化部位は、タンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼの数十によって設定された異なるタンパク質、上で同定された。これは、各PKMTしかし今は、1つまたは2つの基板は、これらの酵素のいくつかのために同定されているまで、複数のタンパク質をメチル化することを示唆している。この問題に取り組むために、我々が導入しているペプチドアレイベースの基質特異性はPKMTsの分析。異なる配列を有するいくつかの基板のメチル化は1アレイ上でテストすることができるので、ペプチドアレイはPKMTsの特異性を特徴づけるための強力なツールです。我々はIntavis SPOT合成機を用いてセルロース膜上にペプチド配列を合成し、様々なPKMTsの特異性を分析した。これらの酵素のいくつかのために、その結果に基づいて、新規のubstratesを同定することができた。例えば、ペプチドアレイを用いることによりNSD1ために、我々はそれがH4のK44の代わりに報告H4K20のメチル化と加えH1.5K168は以前から知られているH3K36上非常に好ましい基質であることを示した。したがって、ペプチド配列は、生化学的にPKMTsを特徴付けるための強力なツールです。
Introduction
過去20年間、いくつかの報告は、細胞の発達および癌のようないくつかの疾患において、翻訳後修飾（PTM）の重要性を実証したが、最近、タンパク質のリジンのメチル化は、他の重要なPTMとして浮上している。最初にヒストンリジンのメチル化は、本質的なクロマチンマークであることが見出されたが、後の研究は、いくつかの非ヒストンタンパク質1~4のリジンのメチル化を示した。リジン残基のεアミノ基へのS-アデノシル-L-メチオニンからのメチル基の連続的な移動は、ヒトゲノム中に60以上のタンパク質を含むタンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼ（PKMTs）と呼ばれる酵素のファミリーによって触媒される。 PKMTsは、最初に特定のリジン残基をメチル化、ヒストン修飾酵素として発見されたが、後の報告は、これらはまた、非ヒストンタンパク質5をメチル化できることを実証した。現在までに、約5000リジンメチル化部位は、異なるタンパク質上で同定された6 </sアップ>が、これらの変更に関与する酵素は、多くの場合、特定されていません。その理由の一つは、最もPKMTsの特異性が広く研究されていないことである。そのため、反復的にPKMTsの新規基質が発見されていることを発生する。 PKMTsの基質特異性の詳細な知識の欠如は、それらの生物学的機能と役割の理解を妨げる。詳細PKMTの特異性を研究するために、1若しくは数個のアミノ酸が異なる多くのペプチド基質のメチル化率を測定する必要があり、理想的には、ペプチドアレイを用いて行われる、比較。得られた特異性プロファイルに基づいて、PKMTsの潜在的基質をさらに研究することができることを同定することができる。
ペプチド配列は、抗体の生化学分析のために広く使用されているツールは、ペプチド修飾酵素およびタンパク質-タンパク質相互作用部位（抗体-抗原、受容体-リガンド）のマッピング7-9である。ペプチドの数百SUCのために必要とされるHアプリケーション。別の方法は、それらの間で樹脂上でのペプチド合成は、非常に一般的に使用され、ペプチド合成のために利用可能であるが、それは、スループットに制限があり、それが比較的高価である。これらの問題は、フランクと同僚10によるSPOT合成法の導入により解決された。 SPOT合成法は、並行して、数百のペプチドの合成を可能にし、平均して、樹脂の合成に比べて安価である。セルロース膜上に合成されたペプチドは、膜から切断し、溶液アッセイにおいて、またはペプチドマイクロアレイ10-13を調製するための遊離ペプチドとして使用することができ、様々なアプリケーションまたはペプチドのいずれかのために直接使用することができる。
SPOT合成は、固体支持体としてのセルロース膜を使用し、標準的なFmoc化学10-13を用いる固相ペプチド合成の変異体である。したがって、ペプチド鎖の合成は、C末端から始まりに向かって進行するリボソームにおける生物学的合成とは対照的に、N末端。セルロース膜は、第一の活性化アミノ酸（ 図1）の取付けのために官能化される。 SPOT法は、自動化ピペッティングシステムを用いて膜上の規定のスポットへの溶媒の液滴中の活性化されたアミノ酸の逐次的送達に基づいている。液体の液滴は、それが後でペプチド合成における化学反応のためのオープンな反応器として機能する円形のウェットスポットを形成し、多孔質膜上に分配される。スポットサイズは体積分注し、膜の吸収能力によって決定され、そのようなスポットの倍数は、アレイとして配置されている。合成のスケールは、スポットサイズ、膜の積載量と相関する。スポットのアレイの密度との間の距離は、スポットサイズを変化させることによって管理されている。セルロース膜はchemicに耐性は、安価で、ペプチド合成において固相として、いくつかの利点を有する水溶液中で安定であり、取り扱いが容易で、ペプチド合成に使用するals。また、その親水性の性質は、いくつかの生物学的アッセイシステムに適しています。 SPOT合成は、ペプチドの必要数に応じて、（ペプチドの1000など）を手動で行うか、自動化することができる。 Intavis（ケルン、ドイツ）から完全に自動化されたSPOT合成は、我々の用途に用いられる。これは、異なる量および異なる長さのペプチドの合成を可能にする。また、段階的合成14,15によって調製することができる線状ペプチドは、定期的に、最大42個のアミノ酸の付加ペプチドが、15〜20アミノ酸長で合成される。しかしながら、アミノ酸の数を増加させることは、ペプチドの品質に影響を与える全体的なカップリング収率の低下につながる。なぜならスポットあたりのペプチドの量が少ないと、製品はしばしば精製が困難であり、個々のペプチドの品質を容易に評価することはできない。したがって、結果は、SPOT PEPTから得IDEの配列のいずれかのペプチドの合成において、所望のペプチド配列を含むタンパク質を合成することによって基準に従って精製し、分析することができる大規模で標準的な方法によって合成されたペプチドを確認しなければならない。それでも、我々は高い信頼性がSPOT合成を見つけ、再現性があることが一般に生じる。 SPOT合成は、いくつかの市販の修飾アミノ酸はまた、合成のために使用することができ、タンパク質構成アミノ酸に制限ペプチドは、側鎖保護基の最終的な切断の前と後に修正されることを可能にし、さらに、それはまた、組み込むことを可能にされていない、リン酸化されたメチル化またはアセチル化アミノ酸は11。
SPOT法により合成固定化ペプチドライブラリーは、直接、多くの生物学的および生化学的アッセイのために使用することができる。我々はPKMTsの基質特異性を調べるために300-400ペプチドを含むペプチドアレイを用いた。酵素によるMODIFIのために陽イオンは、ペプチド配列は、それぞれPKMTと共にインキュベートされ、適切な緩衝液中に[メチル- 3 H]標識-AdoMet。それぞれの基質のメチル化は、オートラジオグラフィー（ 図3）を介して、ペプチド基質へのAdoMetから放射性標識されたメチル基の酵素的転移を下記によって分析される。この手順によって、ペプチドアレイは、同時に異なるペプチド基質のメチル化の研究を可能にする。この方法の1つの重要な利点は、メチル化動態の線形位相の間に、各ペプチドの相対的なメチル化は、解離定数（k 猫 / Kで割った触媒速度定数に比例するように、すべてのペプチドは、競争においてメチル化されていることであるそれぞれのペプチド基質に対する酵素のD）。したがって、各スポットに取り込まれた放射活性の量は、直接特定のペプチドに向かって酵素活性と相関している。使い方ペプチド配列のメチル化実験の結果、PKMTの特異性プロファイルが定義され、この新規基質に基づくことができるが前提とすることができる。ペプチド配列は、ペプチドレベルでの新規基質のメチル化の迅速かつ費用効率的な検証を可能にする。このために、アレイは、標的部位でのLysのAlaの代わりにを含む修飾されたペプチド、ならびに陽性および陰性対照ペプチドと共に予測新規基質を含有する調製される。最後に、新規基質は一緒にターゲットのLysがAlaに変更され、メチル化は、タンパク質レベルで確認することができる変異体を有するタンパク質として調製することができる。結果に応じて、これは、新たに記載されるタンパク質基質のメチル化の潜在的な役割に対処する生物学的研究が続いている。
Protocol
Representative Results
Discussion
SPOT合成ここに記載されるように、タンパク質 – タンパク質相互作用部位をマッピングし、ペプチド修飾酵素の基質認識を調査するための強力な方法である。 SPOT法により合成されたペプチドは、これは、各インスタンスに確認することが困難であり、90％を超える純度21を有することが報告されているが、しかし、SPOT合成は、依然として、いくつかの欠点を有している。した…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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