SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
라이신 메틸화는 신흥 포스트 번역 수정하고이 세포 개발 및 많은 질병에서 중요한 역할을 담당 곳에는 여러 히스톤과 비 히스톤 단백질에 발견되었습니다. 약 5,000 라이신 메틸화 단백질 라이신 methyltransferases의 몇 수십 설정되어 다른 단백질에 확인되었다. 이제이 하나 또는 두 개의 기판이 효소의 여러 가지에 대해 확인 된 그러나까지, 각 PKMT 여러 단백질의 메틸하는 것이 좋습니다. 이 문제에 접근하기 위해, 우리가 도입 펩타이드 어레이 기반의 기질 특이성은 PKMTs 분석. 펩타이드 배열은 서로 다른 시퀀스가 여러 기판의 메틸화가 하나의 어레이 테스트 할 수 있기 때문에 PKMTs의 특이성을 특성화 할 수있는 강력한 도구입니다. 우리는 Intavis SPOT 신디사이저를 사용하여 셀룰로오스 막에 펩타이드 배열을 합성 및 다양한 PKMTs의 특이성을 분석 하였다. 이들 효소의 여러 위해, 결과에 기초하여, 신규 Substrates를 식별 할 수 있습니다. 예를 들어, 펩타이드 어레이를 사용함으로써 NSD1 위해, 우리는 H4의 K44 대신보고를 H4K20의 메틸과 더불어 H1.5K168은 이미 공지 H3K36 위에 매우 바람직한 기판 인 것으로 나타났다. 따라서, 펩타이드 배열은 생화학 PKMTs의 특성을 할 수있는 강력한 도구입니다.
Introduction
지난 20 년 동안, 여러 보고서는 세포 개발 및 암 등 여러 질병,하지만 최근에 단백질 리신 메틸화는 또 다른 중요한 PTM로 떠오르고있다에서 번역 후 변형 (PTM)의 중요성을 보여 주었다. 초기 히스톤 메틸화 라이신 필수적인 염색질 마크 것으로 확인되었지만, 이후의 작업은 여러 비 – 히스톤 단백질 1-4 리신 메틸화 하였다. 리신 잔기의 ε – 아미노기에 S-L 아데노 실 메티오닌의 메틸 기의 순차적 인 전송은 인간 게놈에서 60 개 이상의 단백질을 포함 리신 단백질 Methyltransferases (PKMTs)라는 효소 패밀리에 의하여 촉매된다. PKMTs 처음 특정 라이신 잔기 메틸화 나중에보고들은 또한 비 – 히스톤 단백질 5 메틸화 수 있다고 입증 히스톤 변형 효소로 발견되었다. 지금까지 약 5,000 라이신 메틸화 다른 단백질 6에 확인 된 </s최대>하지만, 이러한 수정에 대한 책임이있는 효소는 종종 식별되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 가장 PKMTs의 특이성이 광범위하게 연구되어 있지 않은 점이다. 따라서, 반복적으로 PKMTs 신규 기질이 발견되어 발생한다. PKMTs의 기질 특이성의 상세한 지식의 결여는 그들의 생물학적 기능 및 역할에 대한 이해를 방해한다. 상세 PKMT의 특이성을 연구하는 하나 또는 몇 개의 아미노산이 다를 많은 펩티드 기질의 메틸화 속도는 측정해야 이상적 펩타이드 어레이를 사용하여 수행되는, 비교. 얻어진 특이성 프로파일에 기초하여, 잠재적 PKMTs 기판은 더 연구 될 수있는 식별 될 수있다.
펩타이드 어레이 널리 항체, 펩티드 변형 효소 단백질 – 단백질 상호 작용 부위 (항체 – 항원, 수용체 – 리간드) 7-9의 맵핑의 생화학 적 분석을위한 도구를 사용한다. 펩타이드 수백는 SUC에 필요한시간 응용 프로그램. 다른 방법들이 매우 일반적으로 사용되는 수지를 합성 펩타이드 중, 펩티드 합성에 사용할 수 있지만, 스루풋에 한계를 가지고 있으며, 이것은 상대적으로 고가이다. 이러한 문제는 프랭크와 동료 (10)에 의해 SPOT 합성 방법의 도입으로 해결이되었습니다. SPOT 합성법 병렬 수백 펩티드의 합성이 가능하며 평균 그것은 합성 수지에 비해 저렴하다. 셀룰로오스 막에 합성 된 펩타이드는 막에서 절단 및 솔루션 분석에서 무료 펩타이드로 사용 또는 펩티드 마이크로 어레이 10-13을 준비 할 수있는 다양한 응용 프로그램 또는 펩티드 직접 사용할 수 있습니다.
SPOT 합성은 고체 지지체로서 셀룰로오스 멤브레인을 사용하며, 표준의 Fmoc- 화학을 채용 10-13 고상 펩티드 합성의 변형이다. 따라서, 펩타이드의 합성은 C 말단에서 시작 향해 진행리보솜에서 합성 생물학적 대조적 N 말단. 셀룰로오스 막은 먼저 활성화 아미노산 (도. 1)의 부착을 위해 관능 화된다. SPOT 방법은 자동 피펫 팅 장치를 이용하여 막에 정의 명소 용매 액적 활성 아미노산의 순차 전달에 기초한다. 액체의 방울은 나중에 펩타이드 합성 화학 반응을위한 오픈 반응기 역할을하는 원형 젖은 자리를 형성하는 다공성 막에 분배된다. 스폿 사이즈가 분배 용적과 멤브레인의 흡수력에 의해 결정되고, 예컨대 스폿의 배수로는 어레이로 배열된다. 합성 스케일 스폿 사이즈와 막의 적재량과 상관을 갖게 할 수있다. 스폿 및 배열 밀도 사이의 거리는 스팟의 크기를 변경함으로써 관리된다. 셀룰로오스 멤브레인 펩티드 합성 고상 같은 여러 가지 장점을 가지고, 그것은 Chemic의 행 저렴 관대수용액에서 안정하고 취급이 용이 한 펩타이드 합성에 사용 ALS. 또한, 친수성 성질은 여러 생물학적 분석 시스템들에도 적합하다. SPOT 합성은 수동으로 수행하거나 필요한 펩티드의 수에 따라 (펩티드에 대한 1000) 자동화 될 수있다. Intavis (쾰른, 독일)에서 완전 자동화 SPOT 합성기는 우리의 응용 프로그램에 사용됩니다. 그것은 다른 양의 서로 다른 길이의 펩티드의 합성을 허용합니다. 또한 단계적 합성 (14,15)에 의해 제조 될 수있는 선형 펩티드는 규칙적 42 아미노산 펩타이드의 첨가에, 15 ~ 20 개의 아미노산 길이로 합성된다. 그러나, 아미노산의 수를 증가시키는 것은 펩티드의 품질에 영향을 전체 결합 수율의 감소를 이끈다. 이 때문에 스폿 당 펩티드의 낮은 양 때문에, 제품은 종종 정제하기 어려운 개별 펩티드의 품질을 용이하게 평가할 수 없다. 따라서 결과의 SPOT pept로부터 얻어진IDE 어레이 정제 펩티드 합성 또는 원하는 펩티드 서열을 함유하는 단백질을 합성 기준에 따라 분석 될 수있는보다 큰 규모의 표준 방법에 의해 합성 된 펩타이드 중 하나를 확인해야한다. 아직도, 우리는 매우 신뢰할 수 SPOT 합성을 발견하고 재현 할 수 일반적으로 발생합니다. SPOT 합성은 펩티드 전과 또한 최종 측쇄 보호 그룹의 절단하고, 이후에 변형 될 수 있도록, 아미노산, 또한 합성에 사용할 수있는 몇 가지 시판 변성 아미노산 proteinogenic에만 제한되지 않으며 또한 혼입 허용 인산화 메틸화 또는 아세틸 아미노산 (11).
SPOT의 고정화 방법으로 합성 펩티드 라이브러리는 직접 많은 생물학적 및 생화학 적 분석에 사용될 수있다. 우리 PKMTs의 기질 특이성을 조사하기 위해 300-400 펩타이드를 포함하는 펩티드 배열을 채용. 효소 후 변형의 경우양이온, 펩티드 배열은 각 PKMT 함께 인큐베이션하고 적절한 완충액 [메틸 3 H] -AdoMet 표지. 각 기판의 메틸화는 오토 라디오 그래피를 통해 펩티드 기질에 AdoMet에서 방사성 표지 된 메틸기의 전사 효소 (도이. 3)에 따라 분석한다. 이 절차에 의해, 펩티드 배열은 동시에 두 펩티드 기질의 메틸화 연구를 허용한다. 이 방법의 한가지 중요한 이점은 모든 펩티드 메틸화 반응 속도의 선형 단계에서, 각각의 펩티드의 상대적인 메틸화가 해리 상수 (K 고양이 / K로 나눈 촉매 속도 상수에 비례 같은 것을, 대회에서 메틸화된다는 것이다 각 펩티드 기질에 대한 효소의 D). 따라서, 각각의 스폿에 혼입 된 방사능의 양을 직접 향해 특정 펩티드의 효소 활성과 관련된다. 사용펩타이드 어레이 메틸화 실험의 결과는, PKMT의 특이성 프로파일은 예견 할 수있는이 새로운 기판에 정의하고 기초 할 수있다. 펩타이드 어레이 펩타이드 수준에서 신규 기판의 메틸화 신속하고 비용 효율적 검증을 허용한다. 이를 위해, 어레이는 표적 부위에서의 라이신 대신 아라 펩타이드를 함유하는 개질뿐만 아니라 양성 및 음성 대조군 펩티드와 함께 예측 된 신규 한 기판을 포함하는 것이 제조된다. 마지막으로, 신규 한 기판은 돌연변이 체와 함께 단백질되는 대상의 Ala가 라이신으로 변경되고, 메틸화 단백질 레벨에서 확인할 수있는 바와 같이 제조 될 수있다. 결과에 따라,이 후, 새롭게 기재된 단백질 기질의 메틸화의 잠재적 역할을 어드레싱 생물학적 연구에 의해 이어진다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된대로 합성 SPOT 단백질 – 단백질 상호 작용 부위를 맵핑하고 수정 펩티드 효소 기질 인식을 조사 할 수있는 강력한 방법이다. SPOT 방법에 의해 합성 된 펩타이드가이 각 인스턴스에서 확인하기 어려운 90 % 이상의 순도 21 것으로보고되었지만 때문에 SPOT 합성은 아직 특정 단점을 갖는다. 따라서, 결과는 예를 이용한 단백질 또는 도메인에 대한 표준 방법에 의해 합성, 정제 된 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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