Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays
Summary
Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
Abstract
Metilación de la lisina es una modificación post-traducción emergentes y se ha identificado en varias proteínas histonas y no histonas, donde juega un papel crucial en el desarrollo de células y muchas enfermedades. Aproximadamente se identificaron 5.000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas, que son fijados por unos decenas de lisina methyltransferases proteína. Esto sugiere que cada PKMT methylates múltiples proteínas, sin embargo hasta ahora sólo uno o dos sustratos se han identificado varias de estas enzimas. Analiza la especificidad de sustrato de arreglo péptido Para abordar este problema, hemos introducido de PKMTs. Matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar la especificidad de PKMTs porque metilación de varios sustratos con diferentes secuencias se puede probar en un array. Hemos sintetizado arrays de péptidos en la membrana de celulosa usando un sintetizador Intavis SPOT y analizado la especificidad de los distintos PKMTs. Basándose en los resultados, para varias de estas enzimas, s novelaubstrates pudieron ser identificados. Por ejemplo, para NSD1 mediante el empleo de arrays de péptidos, mostramos que metila K44 de H4 en lugar de la H4K20 informado y además H1.5K168 es el sustrato altamente preferido sobre el H3K36 anteriormente conocido. Por lo tanto, las matrices de péptidos son herramientas poderosas para caracterizar bioquímicamente los PKMTs.
Introduction
En las últimas dos décadas, varios informes han demostrado la importancia de las modificaciones posteriores a la traducción (PTM) en el desarrollo celular y varias enfermedades como el cáncer, pero recientemente la proteína metilación de la lisina se ha convertido en una otra PTM vital. Mientras histona inicialmente metilación de la lisina se encontró que era una marca esencial de la cromatina, el trabajo más tarde también mostró lisina metilación de varias proteínas no histonas 1-4. La transferencia secuencial de los grupos metilo de la S-adenosil-L-metionina al grupo ε-amino de residuos de lisina es catalizada por una familia de enzimas llamada proteína de lisina methyltransferases (PKMTs) que contiene más de 60 proteínas en el genoma humano. PKMTs fueron descubiertos inicialmente como enzimas histona modificación que metilan residuo de lisina específico, pero informes posteriores demostraron que también podían methylate proteínas no histonas 5. Hasta ahora, se han identificado aproximadamente 5,000 sitios de metilación de la lisina en diferentes proteínas 6 </shasta>, pero las enzimas responsables de estas modificaciones a menudo no se identifican. Una razón para esto es que la especificidad de la mayoría de PKMTs no ha sido ampliamente estudiado. Por lo tanto, se produce de forma recurrente que los nuevos sustratos de PKMTs se descubren. La falta de un conocimiento detallado de la especificidad de sustrato de PKMTs dificulta la comprensión de su función biológica y el papel. Para estudiar la especificidad de un PKMT en detalle, las tasas de metilación de muchos sustratos peptídicos que difieren en uno o unos pocos aminoácidos deben ser medidos y comparados, que se realiza idealmente utilizando arrays de péptidos. Basándose en los perfiles de especificidad resultantes, potenciales sustratos de PKMTs se pueden identificar que puede ser estudiado más.
Arrays de péptidos se utilizan ampliamente herramientas para el análisis bioquímico de anticuerpos, enzimas modificadoras de péptidos y el mapeo de sitios de interacción proteína-proteína (anticuerpo-antígeno, receptor-ligando) 7-9. Se necesitan varios cientos de péptidos para such aplicaciones. Diferentes métodos están disponibles para la síntesis de péptidos, entre ellos Peptide Synthesis sobre resina se utiliza muy comúnmente, pero tiene limitaciones en el rendimiento y es relativamente caro. Estos problemas se resolvieron con la introducción del método de síntesis SPOT por Frank y sus colegas 10. El método de síntesis SPOT permite la síntesis de varios cientos de péptidos en paralelo y en promedio es barato en comparación con la síntesis de resina. Los péptidos sintetizados sobre membrana de celulosa se pueden utilizar ya sea directamente para diversas aplicaciones o péptidos se puede escindir de la membrana y se utiliza como péptidos libres en solución o ensayos para preparar microarrays de péptidos 10-13.
Síntesis SPOT es una variante de la síntesis de péptidos en fase sólida, que utiliza una membrana de celulosa como un soporte sólido y emplea el Fmoc-química estándar 10-13. Por lo tanto, la síntesis de cadenas peptídicas comienza en el extremo C-terminal y procede haciael extremo N-terminal en contraste con la síntesis biológica en los ribosomas. Las membranas de celulosa están funcionalizados para la unión de la primera activado ácidos amino (Fig. 1). El método SPOT se basa en la entrega secuencial de aminoácidos activados en una gotita de disolvente a lugares definidos en la membrana usando un sistema de pipeteo automatizado. La gota de líquido se dispensa en la membrana porosa donde forma una mancha de humedad circular, que posteriormente actúa como un reactor abierto para las reacciones químicas en la síntesis de péptidos. El tamaño del punto se determina por el volumen dispensado y la capacidad de absorción de la membrana, múltiplos de tales puntos están dispuestos como arrays. La escala de la síntesis se correlaciona con el tamaño del punto y la capacidad de carga de la membrana. La distancia entre los puntos y la densidad de arrays se gestionan mediante la variación de los tamaños de punto. Membrana de celulosa tiene varias ventajas como fase sólida en la síntesis de péptidos, es barato, tolerante a la chemicals, utilizados en la síntesis de péptidos y estables en soluciones acuosas y fácil de manejar. Además, su naturaleza hidrofílica lo hace adecuado para varios sistemas de ensayo biológico. Síntesis SPOT puede llevarse a cabo de forma manual o automatizado (para 1000s de péptidos) en función del número requerido de péptidos. Un sintetizador SPOT totalmente automatizado desde Intavis (Köln, Alemania) se utiliza para nuestras aplicaciones. Permite la síntesis de péptidos en cantidades diferentes y de diferente longitud. Los péptidos lineales se sintetizaron regularmente con ácido longitud de 15 a 20 amino, en los péptidos de adición de hasta 42 aminoácidos también se pueden preparar por paso a paso la síntesis 14,15. Sin embargo, aumentar el número de aminoácidos conduce a reducciones en los rendimientos de acoplamiento en general, que afecta a la calidad de los péptidos. Debido a la baja cantidad de péptidos por punto, los productos son a menudo difíciles de purificar y la calidad de los péptidos individuales no se pueden evaluar fácilmente. Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de Pept SPOTarrays IDE deben ser confirmadas ya sea con péptidos sintetizados por métodos estándar en mayor escala, que pueden ser purificados y analizados de acuerdo a los estándares en la síntesis de péptidos o por la síntesis de las proteínas que contienen las secuencias de péptidos deseados. Aún así, encontramos la síntesis SPOT ser altamente fiable y resultados generalmente para ser reproducible. Síntesis SPOT no se limita a proteinogenic aminoácidos, varios ácidos disponibles comercialmente aminoácidos modificados también pueden ser utilizados para la síntesis, lo que permite péptidos para ser modificados antes y después de la escisión final del grupo de protección de cadena lateral y, además, también permite la incorporación de aminoácidos fosforilados, metilados o acetilados 11.
Bibliotecas de péptidos inmovilizados sintetizados por el método de SPOT se pueden utilizar directamente para muchos ensayos biológicos y bioquímicos. Empleamos arrays de péptidos que comprenden 300-400 péptidos para investigar la especificidad de sustrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatión, las matrices de péptidos se incuban con el respectivo PKMT y etiquetado [metil- 3 H] -AdoMet en un tampón apropiado. La metilación del sustrato respectivo se analizó siguiendo la transferencia enzimática de los grupos metilo de AdoMet marcados radiactivamente en el sustrato péptido mediante autorradiografía (Fig. 3). Por este procedimiento, las matrices de péptidos permiten el estudio de metilación de diferentes sustratos peptídicos al mismo tiempo. Una ventaja importante de este método es que todos los péptidos están metiladas en la competencia, de modo que durante la fase lineal de la cinética de metilación, la metilación relativo de cada péptido es proporcional a la constante de velocidad catalítica dividido por la constante de disociación (k cat / K D) de la enzima por el sustrato peptídico respectiva. Por lo tanto, la cantidad de radiactividad incorporada en cada lugar se correlaciona directamente con la actividad enzimática hacia el péptido particular. Utilizando elresultados de un experimento de metilación matriz de péptido, el perfil de especificidad de la PKMT se pueden definir y basándose en este nuevo sustratos pueden ser afirmados. Arrays de péptidos permiten la validación rápida y eficiente costo de la metilación de nuevos sustratos en el nivel de péptido. Para esto, se preparan las matrices que contienen los nuevos sustratos predichos junto con péptidos modificados que contienen un Ala en lugar de Lys en los sitios diana, así como péptidos de control positivos y negativos. Finalmente, los nuevos sustratos se pueden preparar como proteínas junto con mutantes, en los que el objetivo Lys está reemplazado por Ala y la metilación puede ser confirmada a nivel de proteína. Dependiendo de los resultados, esto es seguido por los estudios biológicos que abordan posibles funciones de la metilación de los sustratos proteicos recién descritos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Síntesis SPOT como se describe aquí es un poderoso método para asignar sitios de interacción proteína-proteína e investigar el reconocimiento de sustrato de enzimas peptídicas modificar. Sin embargo, la síntesis SPOT todavía tiene ciertos inconvenientes, porque aunque se informó de los péptidos sintetizados por el método SPOT tener más de 90% de pureza 21 esto es difícil de confirmar en cada caso. Por lo tanto, los resultados tienen que ser reproducida por otros métodos, por ejemplo, el uso de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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