Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.
The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.
Brain mikrovaskulære endotelceller (BMEC) danner monolag som er en integrert del av høyt spesialiserte blod-hjerne-barrieren (BBB). BMECs er innbyrdes forbundet ved synaptiske proteiner festet til en basalmembran. Sammen med pericytes, glatte muskelceller, astrocytic end føtter og sirkulerende blodceller bygge de opp den såkalte nevrovaskulær enhet (NVU) 1. Mot den tidligere oppfatningen av en ugjennomtrengelig barriere mellom blod og sentral-nervøse-system (CNS), er nvu en dynamisk, meget spesifikk og regulert grensesnitt som styrer overgangen av væsker, molekyler og celler mellom cerebrale blodkar og CNS 2- . En dysfunksjon eller dysregulering av nvu kan igangsette og / eller bidra til en rekke nevrovaskulære, infeksiøse, inflammatoriske eller degenerative sykdommer i CNS, som for eksempel iskemisk slag, HIV-encefalopati, multippel sklerose, Alzheimers eller Parkinsons sykdom 3-6.
_content "> The BMEC enkeltlag er tett forseglet av en junctional kompleks bestående av stramt (TJ) og adherens veikryss (AJ) 7. Den høye elektrisk motstand og den lave paracellulære permeabilitet av BBB er i hovedsak basert på TJ proteiner 8. De TJs er komplekser dannet av transmembrane proteiner av claudin og occludin familien, som er knyttet til cytoskjelettet av de endoteliale celler ved adapter molekyler, slik som de zonulaoccludens (ZO) proteiner ZO1-3 4. Adherens knutepunktene er hovedsakelig satt sammen av den integrerte membranprotein vascular endothelial (VE) -cadherin, som er knyttet til cytoskjelettet via catenins 8.Den stramme tetting av BBB hindrer fri utveksling av underlag og celler mellom blod og CSF. Unntak fra denne regelen er lipofile, små molekyler med en molekylvekt <400 Da, som er i stand til å krysse BBB av lipid-mediert diffusjon 9. Passering av større og / ellerhydrofile molekyler, slik som glukose, aminosyrer, peptider, proteiner, og mange medikamenter er begrenset til strengt kontrollerte transcellulær transport systemer 10, som kan klassifiseres i fem hovedkategorier: bærer-mediert transport, ionetransport, aktiv effluks transport, reseptor-mediert transport, og caveolae-mediert transport fire. Disse transportørsystemer hjelpe å opprettholde homeostase i CNS, noe som er nødvendig for en nøyaktig signalgenerering, transduksjon og integrasjon. Videre BMECs er i stand til aktivt å styre overgangen av distinkte molekyler med ekspresjon av en rekke ectoenzymes. Disse enzymene er lokalisert på celleoverflaten og endre spesifikke endogene og eksogene substrater hindrer eller tillater overgang av BBB-11.
Mens CNS ble ansett som et immun-privilegert organ for en lang tid, nyere funn tyder på en ganske dynamisk og tett regulert system av immun overleillance i CNS. De BMECs er kritisk involvert i reguleringen av immunceller sjelevandring. Ved ekspresjon av selektiner på deres overflate lymfocytter blir selektivt løselig indusert til å feste til endotelet. Utskillelsen av kjemokiner som støter med spesifikke reseptorer på leukocytter fører til ekspresjon eller konformasjonelle forandringer av leukocytt-integriner, for eksempel LFA-1 (lymfocytt-funksjon-assosiert antigen 1) og VLA-4 (meget sent antigen-4). Integrinene mediere en fast adhesjon ved å binde deres motreseptorer endotelceller, for eksempel VCAM-I (vaskulær celleadhesjonsmolekyl), ICAM-I (intercellular adhesjonsmolekyl) som muliggjør trans inn i hjernen parenchyma mellom eller gjennom BMECs av BBB 12-14. Disse og andre funn understreker den aktive rollen til endotelet i seg selv ved regulering av immuncellemigrering.
Videre BMECs som en del av nvu er involvert i reguleringen av den cerebrale blodstrøm linked til lokale nevronale metabolske krav. Ved astrocytic stimulering endoteliale celler produserer vasoaktive substanser som for eksempel nitrogenoksyd som fører til avslapping av vaskulære glatte muskelceller 15.
Angiogenese og neurogenesis i utviklings så vel som i den voksne hjernen showet parallelt mønster og utvikling og deler mange egenskaper av regulering 1, 4. Endotelceller er kritisk involvert i disse prosessene 16, 17.
Oppsummert BMECs gi viktige funksjoner for å garantere en riktig utvikling og funksjon av CNS. BBB dysfunksjon er knyttet til mange alvorlige nevrologiske lidelser. Imidlertid har bare svært få mål blitt identifisert på hjernen-blodkar grensesnitt for en spesifikk og effektiv behandling 18. Forenklet in vitro-modeller har blitt brukt for å forstå mekanismene som er involvert i funksjon og regulering av komplekse fysiologiske systemer for en long tid. Isolasjonen som beskrevet av dette manuskriptet og in vitro studie av mus BMECs, gitt den store variasjonen av spesifikke muse knockout-stammer, kan gi en videre forståelse av BBB funksjon og regulering under fysiologiske og patofysiologiske forhold åpner opp nye terapeutiske muligheter.
Blod-hjerne-barrieren dysfunksjon er et kjennetegn på ulike skadelige CNS sykdommer, for eksempel et sammenbrudd av BBB i multippel sklerose omfattende letter CNS invasjon av autoreaktive immunceller og gjør møtet og ødeleggelse av oligodendrocytter. I hjerneinfarkt avbrudd av BBB og den påfølgende dannelse av hjerneødem er kritiske faktorer som påvirker sekundærinfarkt vekst og total overlevelse av pasienter 6. Videre, ved forandringer av BBB i fjerntliggende områder fokale iskemiske lesjoner er i stand til å indusere omfattende funksjonelle forandringer i hjernen. Men de underliggende molekylære mekanismene er i stor grad ukjent fem. I motsetning til dette, den høye tetthet og mangfoldet av effluks-transportører i funksjonelle BMECs reduserer konsentrasjonen av nyttige medikamenter slik som kjemoterapeutika for hjerne maligniteter eller antibiotika for smittsomme sykdommer. Derfor, en dypere forståelse av blod-hjerne-barRier funksjon under fysiologiske og patofysiologiske betingelser er nødvendig for å utvikle farmakologiske midler som er i stand til spesifikt å regulere barrierefunksjon i den favoriserte retningen 21. Pålitelig in vitro modeller av BBB er uunnværlig verktøy for å studere reguleringsmekanismer på BBB.
Mange udødeliggjort hjernen endothelial cellelinjer har blitt etablert og ansatt som in vitro BBB-modeller 22. Disse cellelinjene tilby visse fordeler fremfor primær BMECs som de vokser raskere og holde visse BBB-egenskaper over flere passasjer. Imidlertid kan endothelial cellelinjer ikke fullt ut erstatte primærceller som viktige egenskaper er endret som blander seg med overførbarheten av eksperimentelle funn til in vivo situasjon. For eksempel, det murine hjerne endotel-cellelinje bEnd.5 uttrykker bare lave nivåer av diskontinuerlig fordelte stramme koblings proteiner som fører til høy paracellular permeabilitet 23. BEnd.3, en annen hyppig brukt murine hjerne endotelceller linje, demonstrerer tette og kontinuerlige distribuerte tett veikryss, en høy transendothelial motstand, flere efflux transportører og lav paracellulære permeabilitet. Imidlertid bEND.3 cellelag sammenlignet med primære BMECs mangler en virkelig diskriminering med hensyn til gjennomtrengning av visse transcellulær og paracellulær 24 substrater.
I preparater av primære cellekulturer, kan kontaminerende celler i betydelig grad interfererer med gyldigheten av eksperimentelle funn. I den beskrevne protokoll, blir pyrumicin anvendes som et selektivt middel for endoteliale celler for å oppnå høy renhet. Ikke desto mindre er en vanlig kvalitetskontroll av cellekulturen uunngåelig nødvendig for å garantere for pålitelig eksperimenter. Det finnes flere metoder for kvalitetskontroll, foruten typiske morfologiske egenskapene til endotelceller (se figur 1A), den transendothelial motstanden kan måles eller ekspresjon av endotelial cellemarkør slik som CD31 (se figur 1B) eller von Willebrand faktor (vWF) kan bli evaluert.
Antallet hjerne endotel-celler isolert fra en musehjerne er relativt lav, og for å sette opp en passende cellekultur for flere forsøk, hjernen av flere mus har til å bli slått sammen. I vår erfaring, minst 10 mus trenger å anvendes for ett eksperiment som kan være en begrensende faktor, avhengig av ressursene til den respektive dyrefasilitet. For å unngå skjevhet eller konfunderende faktorer, bør bare mus med en identisk genetisk og miljømessig bakgrunn samles. I motsetning til dette, okser og svin, hjerne endotel-cellepreparater tilveiebringe et stort antall hjerne endotel-celler som er tilgjengelige i en hjernen. Men foruten det ukomplisert avl og bolig, den brede og stadig økende repertoar av tilgjengelige transgene mus gjengir primær murine BMECs som en ideellmodell for å studere blod-hjerne-barrierefunksjon.
Flere viktige funn om funksjonene til BBB og de underliggende molekylære mekanismene har kommet fra studier i 2D vevkultursystemer. Nylig, har 3D-kultursystemer blitt utviklet 25, der endotelceller er plassert innenfor en kollagen matriks gjør dem i stand til å danne hulrom og rørformede nett. Disse nye cellekultursystemer gir mulighet for en enda mer nøyaktig reproduksjon av vaskulære prosesser i den intakte organismen in vivo. Involvering av ytterligere celler av nvu i 3D-cellekultursystemer, slik som pericytes og astrocytter kan revolusjonere in vitro studier av blod-hjerne-barrierefunksjon; første modellene har nylig blitt utviklet 26.
Det er noen anbefalinger for feilsøking. Først av alt sterile arbeids er avgjørende for kvaliteten av endotelial cellekultur. For det andre bør pyrumycin kun tilsettes for cellekulturmedium som brukes i de første to dagene av kultur, kanskje lengre søknad føre til økt MBMEC celledød og lav kvalitet barrierefunksjon. For det tredje bør de enzymene som er benyttet i denne protokollen brukes og lagres i henhold til produsentens instruksjoner; ellers sin rette funksjon kan være kompromittert. Videre kan belegget på cellekulturplater endres dersom endotelceller ikke feste. Konsentrasjoner av fibronektin og kollagen kan endres eller andre matriksproteiner kan tilsettes til belegningsløsningen. Til slutt, alder, kjønn, årstid og miljøforhold innenfor dyret anlegget er viktige faktorer som kan påvirke kvaliteten på MBMEC isolasjon og sammenlignbarhet av eksperimenter. Det bør sikres at forholdene er sammenlignbare mellom uavhengige eksperimenter.
Den beskrevne protokoll bør betraktes som en grunnleggende metode for å isolere neuroimmunological murine BMECs. De isolerte celler kan være used for en rekke programmer for å få ytterligere innsikt i BBB funksjon, for eksempel migrasjonsanalyser, gen og protein expression studier, elektrofysiologiske evalueringer eller permeabilitet eksperimenter. Som nevnt ovenfor, kan 3D-cellekultursystemer av BMECs gi nye muligheter for å studere de komplekse mekanismer som er involvert i reguleringen av BBB i sammenheng med den nvu. Derfor vil isoleringen av primære endotelceller forblir en uvurderlig teknikk innen BBB forskning i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den tverrfaglige Senter for klinisk forskning (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Celler-i-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 – CIM), Universitetet i Münster (til SB og SGM) og av Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 til SB og SGM). Vi takker Heike Blum for de gode illustrasjoner.
bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumine |
Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 d of culture |