Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
A visualização das projeções neuronais de corpo inteiro em embriões é essencial para ganhar uma compreensão de como mamíferos redes neuronais desenvolver. Aqui nós descrevemos um método para rotular in situ um subconjunto do gânglio da raiz dorsal (DRG) projeções axônio para avaliar suas características fenotípicas usando várias linhas de rato geneticamente manipulados. Os neurônios TrkA-positivos são neurônios nociceptores, dedicados à transmissão de sinais de dor. Nós utilizamos uma linha rato TrkA taulacZ para rotular as trajetórias de todos os axônios periféricos TrkA-positivos no embrião intacto mouse. Nós produzir ainda mais a linha TrkA taulacZ sobre um fundo nulo Bax, que essencialmente suprime a apoptose neuronal, a fim de avaliar as questões relacionadas com o crescimento, independentemente de possíveis efeitos das manipulações genéticas na sobrevivência neuronal. Posteriormente, os ratos geneticamente modificados, de interesse são criados com o TrkA TAULACZ / Bax linha nula e está então pronto para o estudo utilizando as técnicas aqui descritas. Esta apresentação inclui informações detalhadas sobre os planos de melhoramento do rato, genotipagem no momento da dissecção, a preparação do tecido, a coloração e de compensação para permitir a visualização de todo o comprimento trajetórias axonal em preparação todo o monte.
Introduction
Estabelecimento de redes neuronais precisas é um processo de desenvolvimento complexo essencial para a funcionalidade do sistema nervoso. Distúrbio neste processo leva à disfunção neuronal que tem sido implicado em doenças neurológicas humanas 1-3. Para estudar os mecanismos moleculares subjacentes de crescimento do axônio e inervação alvo em mamíferos, nós desenvolvemos um protocolo para visualizar as trajetórias axonal de TrkA-expressando neurônios sensoriais usando uma combinação de duas linhas de rato geneticamente modificados.
TrkA é um receptor para o factor de crescimento dos nervos NGF e é um marcador funcional de neurónios sensoriais nociceptivos 4. TrkA é altamente expressa em neurónios nociceptivos durante o desenvolvimento precoce e medeia a sobrevivência de neurónios dependente de NGF, o crescimento axonal, arborização e alvo de inervação 5-9. Em ratinhos TrkA taulacZ, o gene de TrkA tipo selvagem é substituído por uma expressão de c taulacZassette 10, de tal modo que a morfologia axonal de neurónios TrkA-positivos putativos pode ser visualizado por β-gal (X-gal) 11 coloração. Usando uma linha de TrkA taulacZ / WT heterozigótico, pode-se examinar os factores que podem regular ou interferir com o desenvolvimento de projecções aferentes sensoriais in vivo.
Além disso, a expressão de TrkA está ausente em ratinhos homozigóticos TrkA taulacZ / taulacZ, que pode, portanto, ser utilizados para avaliar a promoção do crescimento axonal na ausência de mecanismos de sinalização NGF / TrkA. Uma vez que os neurónios nociceptivos dependem sinalização NGF / TrkA não só para o crescimento axonal, mas também para a sobrevivência, que empregam uma outra linha de ratinhos, a que falta o gene de pró-apoptótica Bax, para inibir a apoptose em neurónios DRG embrionárias, salvando-los de morte celular que é de outra maneira observada na ausência de sinalização TrkA. O Bax – / – fundo 12 permite, assim, para o molecudissecção lar de vias de sinalização que afectam especificamente 7-9,13-15 crescimento axonal. Em TrkA – / -: Bax – / – ratos, neurónios DRG sobreviver, mas inervação aferente sensorial na pele é completamente abolida 14,15. Podemos ativar seletivamente as vias de sinalização para determinar suas respectivas contribuições para o desenvolvimento de projeções axônio. A utilidade deste método é que ele permite a avaliação de mudanças na fenótipos crescimento axonal quando diferentes modificações genéticas são criados para a TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – ou TrkA taulacZ / WT: Bax – / – fundos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O processo de coloração X-gal acima descrito de ratos embrionárias TrkA taulacZ permite a visualização rápida e detalhada de projeções axônio de longa distância no embrião fixa intacta. Por causa do fundo nulo Bax estes ratos permitir a sondagem de mecanismos de sinalização que podem contribuir para o crescimento do axônio e sobrevivência neuronal. O cruzamento com camundongos transgênicos ou knockout de interesse permite uma avaliação abrangente de fenótipos axonal e pode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Louis Reichardt para os ratos TrkA taulacZ e Dr. Annette Markus para discussão perspicaz e sugestões. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Fundação Burke, bem como Fundação Whitehall bolsa de investigação 2010-08-61, uma bolsa de investigação Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), conceder ZB1-1102-1 do Christopher e Dana Reeve Foundation, e concede 1R01EY022409 e 3R01EY022409-01S1 do National Eye Institute, a JZ. KJo é um companheiro Goldsmith.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
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