We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
تصور كامل طول التوقعات العصبية في الأجنة أمر ضروري للحصول على فهم كيفية تطور الثدييات الشبكات العصبية. نحن هنا تصف طريقة لتسمية في الموقع مجموعة فرعية من عقدة الجذر الظهري (DRG) التوقعات محور عصبي لتقييم خصائصها المظهرية باستخدام عدة خطوط الماوس التلاعب بها وراثيا. الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية هي الخلايا العصبية مستقبلة الأذية، مخصصة لنقل إشارات الألم. نحن نستخدم خط الماوس TrkA taulacZ لتسمية مسارات كافة محاور الطرفية-TrkA إيجابي في جنين الفأر سليمة. نحن أبعد تولد خط TrkA taulacZ على خلفية فارغة باكس، الذي يلغي أساسا موت الخلايا المبرمج العصبية، من أجل تقييم الأسئلة المتعلقة النمو بشكل مستقل عن الآثار المحتملة للالتلاعب الجيني على بقاء الخلايا العصبية. وفي وقت لاحق، هي ولدت الفئران المعدلة وراثيا في المصالح مع TrkA taulACZ / باكس خط باطل ونحن على استعداد لدراسة باستخدام التقنيات الموصوفة هنا ثم. ويشمل هذا العرض معلومات مفصلة عن خطط تربية الماوس، التنميط الجيني في وقت تشريح، وإعداد الأنسجة، وتلطيخ والمقاصة للسماح لرؤية كامل طول مسارات محور عصبي في إعداد كامل جبل.
إنشاء شبكات الخلايا العصبية الدقيقة هي عملية التنموية المعقدة ضرورية لوظائف الجهاز العصبي. اضطراب في هذه العملية يؤدي إلى اختلال الوظائف العصبية التي تورطت في الأمراض العصبية الإنسان 1-3. لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء نمو محور عصبي وتعصيب المستهدفة في الثدييات، وقد وضعنا بروتوكولا لتصور مسارات محور عصبي من TrkA، معربا عن الخلايا العصبية الحسية باستخدام مزيج من اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا.
TrkA هو مستقبلات لعامل نمو الأعصاب NGF، وهو علامة وظيفية من الخلايا العصبية الحسية مسبب للألم 4. وأعرب عن TrkA غاية في الخلايا العصبية مسبب للألم خلال التنمية في وقت مبكر ويتوسط بقاء الخلايا العصبية التي تعتمد على NGF، والنمو محور عصبي، تشجر والهدف تعصيب 5-9. في الفئران TrkA taulacZ، يتم استبدال البرية نوع الجينات TrkA من قبل taulacZ التعبير جassette 10، على ان يكون التشكل محور عصبي من الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية المفترضة يمكن تصور كتبها β-غال (X-غال) تلطيخ 11. باستخدام سطر TrkA taulacZ / WT متخالف، يمكننا دراسة العوامل التي قد تتداخل مع تنظيم أو تطوير التوقعات وارد الحسية في الجسم الحي.
وعلاوة على ذلك، TrkA التعبير غائبة في الفئران متماثلة اللواقح TrkA taulacZ / taulacZ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم نمو محور عصبي تعزيز آليات في غياب NGF / TrkA الإشارات. منذ الخلايا العصبية مسبب للألم تعتمد على NGF / TrkA يشير ليس فقط للنمو محور عصبي، ولكن أيضا من أجل البقاء، ونحن توظيف خط الماوس آخر، تفتقر إلى الجين باكس المؤيد لأفكارك، لمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية DRG الجنينية، إنقاذهم من موت الخلايا التي هي على خلاف ذلك لوحظ في غياب TrkA الإشارات. وباكس – / – 12 الخلفية مما يسمح للmolecuتشريح لار من مسارات الإشارات التي تؤثر على وجه التحديد 7-9،13-15 نمو محور عصبي. في TrkA – / -: باكس – / – الفئران، والخلايا العصبية DRG البقاء على قيد الحياة، ولكن الحسي تعصيب وارد في الجلد وألغيت تماما 14،15. يمكننا تفعيل انتقائي مسارات إشارات لتحديد مساهماتها في تطوير التوقعات محور عصبي. فائدة هذه الطريقة هي أنها تسمح للتقييم التغيرات في الظواهر نمو محور عصبي عندما تربى تعديلات وراثية مختلفة على TrkA taulacZ / taulacZ: باكس – / – أو TrkA taulacZ / WT: باكس – / – الخلفيات.
الإجراء المبين أعلاه تلطيخ X-غال من الفئران الجنينية TrkA taulacZ يسمح لتصور سريع ومفصل من التوقعات محور عصبي لمسافات طويلة في الجنين ثابتة على حالها. بسبب الخلفية فارغة باكس هذه الفئران تسمح للتحقق من الإشارات الآليات التي يمكن أن تسهم في نمو كل من محور عص?…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لويس Reichardt للفئران TrkA taulacZ والدكتور أنيت ماركوس للمناقشة والاقتراحات الثاقبة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مؤسسة بيرك وكذلك مؤسسة وايت هول منحة بحثية 2010-08-61، منحة بحثية من أجنحة لمؤسسة الحياة (WFL-US-028/14)، منح ZB1-1102-1 من كريستوفر ودانا ريف مؤسسة، والمنح 1R01EY022409 و3R01EY022409-01S1 من المعهد الوطني للعيون، لJZ. عمليات الخفجي المشتركة هو زميل جولدسميث.
Company | Catalog Number | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
PBS | Life Tech | 10010-023 |
Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
Incubator | Labline | Model 120 |
Insect pins | FST | 26000-30 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
Primers | IDT | custom DNA primers |
Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
Takara LA buffer | Takara | RR002A |
Takara LA Taq | Takara | RR002A |
PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
Dissecting microscope | Leica | M205A |
Camera | Leica | DFC310FX |
Ring light | Leica | MEB110 |
Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |