Hele-mount Imaging af museembryo Sensory Axon Fremskrivninger
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
Visualiseringen af fuld længde neuronale projektioner i embryoner er vigtigt at få en forståelse af, hvordan pattedyr neuronale netværk udvikle sig. Her beskriver vi en metode til at mærke på stedet en delmængde af dorsale ganglion (DRG) Axon fremskrivninger at vurdere deres fænotypiske karakteristika ved hjælp af flere genetisk manipulerede mus linjer. TrkA-positive neuroner er nociceptor neuroner, dedikeret til transmission af smerte signaler. Vi benytter en TrkA taulacZ mus linje til at mærke baner for alle TrkA-positive perifere axoner i ubeskadiget museembryo. Vi yderligere avle TrkA taulacZ linje på en Bax null baggrund, som i det væsentlige afskaffer nerveapoptose, for at vurdere vækst-relaterede spørgsmål uafhængigt af mulige effekter af genetiske manipulationer på neuronal overlevelse. Efterfølgende genmodificerede mus af interesse avlet med TrkA TaulACZ / Bax null linje og er herefter klar til undersøgelse under anvendelse af de heri beskrevne teknikker. Denne præsentation indeholder detaljerede oplysninger om mus avlsplaner, genotypebestemmelse ved dissektion, forberedelse væv, farvning og clearing at give mulighed for visualisering af fuld længde axonale baner i hel-mount forberedelse.
Introduction
Etablering af præcise neuronale netværk er en kompleks udviklingsproces afgørende for funktionaliteten af nervesystemet. Forstyrrelser i denne proces fører til neuronal dysfunktion, som er blevet impliceret i humane neurologiske sygdomme 1-3. For at undersøge de underliggende molekylære mekanismer i axon vækst og mål innervation hos pattedyr, har vi udviklet en protokol til at visualisere axonale baner TrkA-udtrykkende sensoriske neuroner ved hjælp af en kombination af to genetisk modificerede mus linjer.
TrkA er en receptor for nervevækstfaktor NGF og er en funktionel markør for nociceptive sensoriske neuroner 4. TrkA er højt udtrykt i nociceptive neuroner i den tidlige udvikling og medierer NGF-afhængig neuron overlevelse, Axon vækst, arborization og mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ mus, er vildtype TrkA gen erstattet af en taulacZ udtryk cassette 10, således at axonal morfologi af formodede TrkA-positive neuroner kan visualiseres ved β-gal (X-gal) farvning 11. Ved hjælp af en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersøge faktorer, der kan regulere eller forstyrre udviklingen af sensoriske afferente fremskrivninger in vivo.
Desuden TrkA-ekspression er fraværende i homozygote TrkA taulacZ / taulacZ mus, som derfor kan anvendes til at vurdere axon vækstfremmende mekanismer i fravær af NGF / TrkA signalering. Da nociceptive neuroner afhænger NGF / TrkA signalering ikke kun for axon vækst, men også for at overleve, vi anvender en anden mus linje, der mangler pro-apoptotiske Bax-genet, til at inhibere apoptose i embryoniske DRG-neuroner, redning dem fra celledød, der ellers observeret i fravær af TrkA signalering. Bax – / – baggrund 12 giver således mulighed for molecular dissektion af signalveje, der specifikt berører Axon vækst 7-9,13-15. I TrkA – / -: Bax – / – mus, DRG-neuroner overlever, men sensorisk afferent innervation i huden er helt afskaffet 14,15. Vi kan selektivt aktivere signalveje for at bestemme deres respektive bidrag til udviklingen af Axon fremskrivninger. Anvendeligheden af denne metode er, at det giver mulighed for vurdering af ændringer i axonale vækst fænotyper, når forskellige genetiske modifikationer er avlet på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – eller TrkA taulacZ / WT: Bax – / – baggrunde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne X-gal farvningsprocedure af embryonale TrkA taulacZ mus giver mulighed for en hurtig og detaljeret visualisering af langdistance Axon fremskrivninger i ubeskadiget faste foster. På grund af Bax null baggrund disse mus muliggøre sondering af signalering mekanismer, der kan bidrage til både axon vækst og neuronal overlevelse. Parring med transgene eller knockout-mus af interesse muliggør omfattende vurdering af axonale fænotyper og kan tjene som nyttig vejledning fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Louis Reichardt for TrkA taulacZ mus og Dr. Annette Markus for indsigtsfuld diskussion og forslag. Dette arbejde blev støttet af startup midler fra Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsbevilling 2010-08-61, en forskningsbevilling fra Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), giver ZB1-1102-1 fra Christopher & Dana Reeve Foundation, og tilskud 1R01EY022409 og 3R01EY022409-01S1 fra National Eye Institute, til JZ. KJO er en Goldsmith fyr.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
