Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
La visualización de proyecciones neuronales de larga duración en los embriones es esencial para obtener una comprensión de cómo los mamíferos desarrollan redes neuronales. Aquí se describe un método para etiquetar in situ un subconjunto de ganglios de la raíz dorsal (GRD) proyecciones axón para evaluar sus características fenotípicas utilizando varias líneas de ratones manipulados genéticamente. Las neuronas TrkA-positivo son las neuronas nociceptivas, dedicada a la transmisión de señales de dolor. Utilizamos una línea de ratones TrkA taulacZ para etiquetar las trayectorias de todos los axones periféricos TrkA-positivo en el embrión de ratón intacto. Criamos aún más la línea TrkA taulacZ sobre un fondo nulo Bax, que esencialmente suprime la apoptosis neuronal, a fin de evaluar las preguntas relacionadas con el crecimiento independientemente de los posibles efectos de las manipulaciones genéticas sobre la supervivencia neuronal. Posteriormente, los ratones modificados genéticamente de interés son criados con el TrkA TaullacZ / Bax línea nula y son entonces listo para su estudio usando las técnicas descritas en el presente documento. Esta presentación incluye información detallada sobre los planes de cría de ratón, genotipificación en el momento de la disección, la preparación del tejido, la coloración y el desmonte para permitir la visualización de larga duración trayectorias axonal en la preparación de todo el montaje.
Introduction
Establecimiento de redes neuronales precisos es un complejo proceso de desarrollo esencial para la funcionalidad del sistema nervioso. Perturbación en este proceso conduce a la disfunción neuronal que ha sido implicado en enfermedades neurológicas humanas 1-3. Para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de crecimiento de los axones y la inervación diana en mamíferos, hemos desarrollado un protocolo para visualizar las trayectorias axonales de TrkA-expresión de las neuronas sensoriales usando una combinación de dos líneas de ratones modificados genéticamente.
TrkA es un receptor para el factor de crecimiento nervioso NGF y es un marcador funcional de las neuronas sensoriales nociceptivas 4. TrkA es altamente expresado en las neuronas nociceptivas durante el desarrollo temprano y media la supervivencia de neuronas dependientes de NGF, el crecimiento axonal, la arborización y el objetivo inervación 5-9. En los ratones TrkA taulacZ, el gen TrkA de tipo salvaje se sustituye por una expresión taulacZ cassette 10, de tal manera que la morfología axonal de las neuronas TrkA-positivos putativos se puede visualizar por β-gal (X-gal) tinción 11. Mediante una línea de TrkA taulacZ / WT heterocigóticos, podemos examinar los factores que pueden regular o interferir con el desarrollo de proyecciones aferentes sensoriales en vivo.
Por otra parte, la expresión de TrkA está ausente en ratones homocigotos TrkA taulacZ / taulacZ, que por lo tanto pueden ser utilizados para evaluar el crecimiento del axón promoción de mecanismos en la ausencia de la señalización de NGF / TrkA. Dado que las neuronas nociceptivas dependen de NGF / TrkA señalización no sólo para el crecimiento axonal, sino también para la supervivencia, empleamos otra línea de ratones, que carecen del gen Bax pro-apoptóticos, para inhibir la apoptosis en las neuronas DRG embrionarias, rescatar de la muerte celular que es lo contrario observado en ausencia de la señalización de TrkA. El Bax – / – fondo 12 por lo tanto permite la molecudisección lar de las vías de señalización que afectan específicamente axón 7-9,13-15 crecimiento. En TrkA – / -: Bax – / – ratones, DRG neuronas sobreviven, pero inervación aferente sensorial en la piel es la supresión total de 14,15. Podemos activar selectivamente las vías de señalización para determinar sus respectivas contribuciones al desarrollo de las proyecciones de los axones. La utilidad de este método es que permite la evaluación de los cambios en los fenotipos de crecimiento axonal cuando diferentes modificaciones genéticas se crían en el TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – o TrkA taulacZ / WT: Bax – / – fondos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento de tinción X-gal-descrita anteriormente de ratones embrionarios TrkA taulacZ permite la visualización rápida y detallada de las proyecciones de los axones de larga distancia en el embrión intacto fijo. Debido a la nula fondo Bax estos ratones permiten el sondaje de los mecanismos que pueden contribuir tanto al crecimiento del axón neuronal y la supervivencia de señalización. El apareamiento con transgénicos o knockout ratones de interés permite una evaluación compl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Louis Reichardt para los ratones TrkA taulacZ y Dr. Annette Markus para el debate profundo y sugerencias. Este trabajo fue apoyado por fondos de puesta en marcha de la Fundación Burke, así como la Fundación Whitehall beca de investigación 2010-08-61, una beca de investigación de Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), conceder ZB1-1102-1 del Christopher & Dana Reeve Foundation, y subvenciones 1R01EY022409 y 3R01EY022409-01S1 del Instituto Nacional del Ojo, a JZ. KJO es un compañero de Goldsmith.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
