Fjärr Limb Ischemisk Förkonditionering: neuroprotektiv Teknik Gnagare

Summary

Fjärr ischemisk prekonditionering (RIP) är en metod för konditionering vävnader mot skadlig stress. Vi har etablerat en metod för fjärr ischemi på bakbenet, genom att blåsa en blodtrycksmätare manschetten under 5-10 min. De neuroskyddande kapacitet RIP har visats i en modell av näthinnedegeneration hos gnagare.

Abstract

Subletal ischemi skyddar vävnader mot efterföljande allvarligare ischemi genom uppreglering av endogena mekanismer i den drabbade vävnaden. Subletal ischemi har också visat sig uppreglera skyddsmekanismer i avlägsna vävnader. En kort period av ischemi (5-10 min) i den bakre delen av däggdjur inducerar själv skyddande svar i hjärnan, lunga, hjärta och näthinnan. Effekten är känd som fjärr ischemisk prekonditionering (RIP). Det är ett terapeutiskt lovande sätt att skydda vitala organ, och är redan i kliniska prövningar för hjärt- och hjärnskador. Denna publikation visar en kontrollerad, minimalt invasiv metod för att tillverka en lem – specifikt bakbenet hos en råtta – ischemisk. En blodtrycksmanschett utvecklats för användning i humana nyfödda är ansluten till en manuell blodtrycksmätare och används för att applicera 160 mmHg tryck runt den övre delen av bakbenet. En sond utformad för att detektera hud temperatur används för att verifiera ischemien, genom registrering av minskningen av hudens temperatur orsakad av tryckinducerad ocklusion av benens artärer, och ökningen i temperatur som följer frisättning av manschetten. Denna metod för RIP ger skydd för råtta näthinnan mot starkt ljus-inducerad skada och degeneration.

Introduction

Överlevnaden för de flesta, kanske alla, kan vävnader i ansiktet av metabolisk stress förbättras genom tidigare konditionering med en period av subletal ischemi ^1,2. Ischemisk prekonditionering (IP) i praktiken är exponeringen av vävnad till subletal ischemi, innan vävnads erfarenheter mer allvarliga stressfaktorer, såsom en efterföljande ischemisk skada. I djurmodeller tillhandahåller IP-slående skydd till hjärnan, näthinnan, hjärtat och lungorna ^3-6. På motsvarande observationer i strokepatienter visade ett samband mellan tidigare övergående ischemiska attacker och bättre kliniska utfall ^7,8. IP skyddar också retinala fotoreceptorer från icke-ischemiska skador ^9.

Effektiviteten av IP i olika vävnader och skador tyder på att den aktiverar en medfödd mekanism för cellöverlevnad närvarande i all vävnad. Ischemisk prekonditionering av hjärtmuskeln har föreslagits att ha skyddande effekter genom uppregleringhypoxi inducerbara faktor (HIF), känd för att reglera många metaboliska vägar genom frisättning av adenosin eller genom öppnandet av mitokondriella ATP kaliumkanaler ^10,11. Adenosinfrigivning och ATP kaliumkanaler är inblandade i cerebral ischemi, men undersökningar av neuroprotektiva mekanismer ischemisk konditione hittills har fokuserat på ändringar av anti-excitotoxicity, anti-apoptotiska och anti-inflammatoriska vägar ^12,13. Totalt sett är begränsad förståelse för den molekylära processen för ischemisk konditionering för att skydda neuroner.

Fjärr ischemiska prekonditionerande försök att konditionera avlägsna kritiskt viktiga organ (hjärta, hjärna, lunga) genom att generera ischemi i mindre kritiska vävnader. Fjärr ischemisk prekonditionering (RIP) med användning av bakbenet har visats vara neuroskyddande i gnagarmodeller av stroke ^14-17. Den metod som beskrivs av oss ger en enkel, tillförlitlig och icke-invasiv protocol för att inducera RIP.

De allra flesta av RIP protokoll involverar bakbenet, förmodligen på grund av lårbensartären ligger i den övre bakbenen lätt kan identifieras och nås för kirurgisk kläm och blodtomsmanschett. I invasiv lem ischemiska studier för att studera hjärnan och hudskydd är ischemiinducerad genom att separera lårbensartären från ljumsk ligament och spännlårbensartären ^2,15,18.

Den ischemi till följd av antingen lem ansamling av inflammatoriska celler eller lårbensartären kläm har bekräftats av förändringar på benet, inklusive en förlust av puls, minskad syresättning och en nedgång i hudtemperatur. Fjärr ischemi kan bekräftas av förlusten av pulsen med hjälp av laser Doppler eller ultraljud Doppler ^17-19. Hudtemperatur kan användas som alternativ till Doppler även om förhållandet ej är linjärt ^20,21. Korrekta temperatur inspelningar är vanliga i laboratorier och burklätt införlivas i avlägsna ischemiska studier.

Ett alternativ till femoral kläm kirurgi är induktion av ischemi med hjälp av en kompressor. Tourniquet ansökan ger jämförbar ischemi som uppnås med fartyg kläm; Kutchner et al., jämfört invasiv lårbensartären kläm till en icke-invasiv tryckförband och fann båda metoderna stoppas blodflödet till extremiteterna och minskade skador huden på ett plastikkirurgi modell av hudfliken ischemi ^18. Ansamling av inflammatoriska celler antingen benet eller armen och höjning av manschettrycket till över systoliskt blodtryck har visat sig vara skyddande mot ischemisk skada i svin och människor ^17,19,22.

Olika tryckförband metoder för inducering fjärr ischemisk inkludera användningen av en blodtrycksmanschett eller ett elastiskt band ^17,22,23. Emellertid är användningen av ett elastiskt band för att inducera ischemi en osäker metod, potentiellt ger upphov till en oreglerad mängd tryck ilem, med trycket stiger över 500 mmHg registreras hos människor ^24. Vidare, ischemi med användning av ett elastiskt band leder till muskelskador i råttor efter avlägsnandet av bandet ^23, enligt bedömning av Evans Blue Dye, en in vivo-markör för myofiber permeabilitet ^25. I motsats härtill kan uppnås avgivning av ett reglerat tryck till stasen användning av en blodtrycksmanschett ansluten till en sfygmomanometer ^17,19,22,26.

I denna studie var en lätt modell skada ljusmätare degeneration som används för att visa den neuroprotektiva effekten av fjärr ischemisk prekonditionering. Fjärr ischemi framkallades omedelbart före lätt skada, och förhindrade efterföljande ljusmätare degeneration vilket bekräftas av retinal funktionstest. Den medföljande videon kommer att visa tillämpningen av icke-invasiv fjärr ischemi.

Protocol

Etik uttalande: Protokollet följer riktlinjerna för djurskötsel av University of Sydney, AEC # 5657. Anestesi godkändes av djuretik kommitté (University of Sydney, AEC # 5657). 1. Förberedelse av utrustning Använd realtid spårning hudtemperatur. Slå på datorn, och datainsamling hårdvara. Öppna temperatur inspelningsprogram och justera temperaturinställning till mellan 30-35 ° C och provtagningsfrekvens till 100 msek. Tillval: Sätt rektal termomet…

Representative Results

En blodtrycksmanschett höjs till över 160 mmHg stoppar blodflödet till bakbenet som ses tydligt i figur 1B. Avsaknaden av vävnadssyresättning resulterade i en minskning av djurets fot temperatur under en ischemi-reperfusion protokollet (Figur 2). Foten temperatur (33 ° C) var lägre än kärntemperatur och tillförlitligt reduceras under manschettryck höjd (31 ° C) stiger när manschetten var tömd (32 ° C). En enda 1.000 lux ljus skada levererades till dim höjas albinoråttor…

Discussion

Gnagare bakbens ischemi framgångsrikt induceras med en manuell blodtrycksmätare och manschett leverera neuroprotektion till fotoreceptorer i näthinnan. Ett konstaterande överensstämmer med ischemisk konditionering inducerad skydd av fotoreceptorer från ljus skada ^9,28.

I huvudsak orsakar fjärr ischemi kort syrebrist till vävnader. Följaktligen, har fjärr ischemisk prekonditionering många likheter med ischemisk konditionering eller alternativt benämnd ischemisk tolerans…

Materials

Gold series DuraShock Hand Aneroid Sphygmomanometer	Welch Allyn	DS56	Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 Tube, 10 Pack	Welch Allyn	5082-102-1	Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor	Welch Allyn	5082-178	Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod	AD Instruments	ML 309	skin tempertature unit
Skin temperture probe	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Skin temperature recorder
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Towel			optional: awake remote ischemia
Isoflo – 100% Isoflurane -250 ml	Abbot Animal Health	05260-05	optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil – ketamine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium – Xylazine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia