Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
Murins et oesophagiennes humaine myofibroblastes sont générés par digestion enzymatique. Nouveau-né (8-12 jours old) murin œsophage est récolté, hachée, lavée et soumise à une digestion enzymatique avec de la collagénase et de la dispase pendant 25 min. Spécimens de résection de l'œsophage humaines sont dépouillés de la musculeuse et adventice et la muqueuse restante est hachée, et soumis à une digestion enzymatique avec de la collagénase et dispase jusqu'à 6 h. Les cellules cultivées expriment α-SMA et vimentine et desmine expresse faiblement ou pas du tout. Les conditions de culture ne sont pas propices à la croissance des cellules épithéliales, hématopoïétiques ou cellules endothéliales. pureté de la culture est encore confirmée par l'évaluation de cytométrie en flux de l'expression des marqueurs de surface de cellule hématopoïétique de potentiel de contamination et les cellules endothéliales. La technique décrite est simple et conduit à la production de non-cohérente, hematopoieitc cellules stromales non-endothéliales. Les limites de cette technique sont inhérents à l'utilisation decultures primaires dans les études de biologie moléculaire, à savoir, la variabilité inévitable rencontre entre les cultures établies dans différents souris ou les humains. Les cultures primaires sont cependant une réflexion plus représentatif de l'état in vivo par rapport aux lignées cellulaires. Ces procédés fournissent également la capacité des chercheurs à isoler et culture des cellules stromales de différentes conditions cliniques et expérimentales, ce qui permet des comparaisons entre les groupes. Les cellules stromales de l'œsophage caractérisés peuvent également être utilisés dans des études fonctionnelles de l'enquête interactions épithéliales stroma dans les troubles de l'œsophage.
Introduction
interactions épithéliales stromales sont impliqués dans la régulation d'une variété de fonctions du tractus gastro-intestinaux, y compris la régénération des muqueuses, la réparation, la fibrose, et la carcinogenèse 1,2. Ces interactions ont été le mieux étudié dans l'intestin grêle et du côlon et peuvent de même jouer un rôle dans les troubles de la muqueuse de l'œsophage 3. Une sous-population de myofibroblastes et de cellules stromales intestinal du côlon a été démontré appelées à participer à la médiation de la lésion tissulaire, l'inflammation et la réparation de 4,5. Dans le tractus gastro-intestinal distale, ces cellules en forme de fuseau sont situés à côté de la membrane basale à l'interface entre l'épithélium et la lamina propria et sont définis comme α-SMA et vimentine positif, pan-cytokératine négative, et faiblement positive ou desmine négatif 5.
Le stroma de l'œsophage n'a pas été caractérisé rigoureusement au niveau cellulaire ou moléculaire. Notre travail dans l'œsophage murin a démonstrated α-SMA cellules et vimentine dans le stroma de l'œsophage, parfois sous-jacentes à l'épithélium malpighien 6. interactions stroma-épithéliales ont été impliqués dans les troubles de la muqueuse de l'œsophage, tels que gastro-oesophagien blessure médiée 6 et l'oesophagite eosinophile 3. Sténoses fibreuses sont également une complication connue de cellules stromales de blessures et de l'œsophage ont été impliqués dans la pathogenèse de la fibrose gastro-intestinal. Isolement de ces cellules permettra d'effectuer les études nécessaires pour enquêter sur les voies de signalisation dérangés.
Cette présentation fournit les techniques nécessaires pour créer des cultures primaires de α-SMA, myofibroblastes positifs vimentine positifs tels que les lacunes existantes dans les connaissances concernant les voies de signalisation de médiation ces interactions peuvent être abordés. La technique décrite a été utilisée avec succès par les auteurs à établir primaires myofibroblastes coliques murins 7 et further adapté pour l'établissement de murin 6 et cellules humaines stromales oesophagiennes myofibroblastes-like.
Nous décrivons ici les conditions nécessaires pour établir et caractériser ces cultures établies à partir de la souris ou de l'œsophage humaine avant de les utiliser dans des études fonctionnelles futures. Les cultures peuvent être cultivées et utilisées pour un maximum à 15 passages. L'isolement et l'établissement de cultures primaires par les méthodes décrites ci-dessous génère des cellules stromales de phénotype des myofibroblastes; α-SMA, vimentine positif, et faiblement positif ou négatif pour la desmine et cytokératine négative. Ce phénotype est distinct du phénotype de l'œsophage fibroblastes qui est principalement la vimentine positif, négatif α-SMA 3 ou l'α-SMA positif, la vimentine phénotype négatif de la musculaire muqueuse 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques pour la production de culture primaire sont généralement similaires lors de l'utilisation du tissu murin ou humain avec hacher et de digestion fois adaptés à la taille de tissu. Notre expérience avec le tissu murin suggère que l'utilisation des méthodes décrites ci-dessus entraîne régulièrement dans l'établissement réussi de cultures primaires. Les étapes critiques au sein du protocole comprennent la stérilisation du matériel chirurgical et en suivant des techniques stériles s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
