Isolering av Myofibroblaster från mus och Human matstrupen
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
Murina och mänsklig esofagus myofibroblaster genereras via enzymatisk nedbrytning. Neonatal (8-12 dagar gamla) murina matstrupe skördas, malet, tvättas, och utsattes för enzymatisk spjälkning med kollagenas och dispas i 25 min. Mänskliga esofagus resektion exemplaren tagen muscularis propria och adventitia och resterande slemhinnan är malet, och utsattes för enzymatisk spjälkning med kollagenas och dispas för upp till 6 timmar. Odlade celler uttrycker α-SMA och vimentin och express desmin svagt eller inte alls. Odlingsbetingelser är inte bidrar till tillväxten av epitelial, hematopoetisk eller endotelceller. Kultur renhet bekräftas ytterligare av flödescytometrisk utvärdering av cellytmarkör uttryck för potentiell kontamine hematopoetiska och endotelceller. Den beskrivna tekniken är enkel och resulterar i en konsekvent alstring av icke-hematopoieitc, icke-endoteliala stromaceller. Begränsningar med denna teknik är inneboende i användningen avprimära kulturer i molekylärbiologiska studier, dvs, den oundvikliga variabiliteten stött mellan kulturer etablerade på olika möss eller människor. Primära kulturer är dock en mer representativ bild av tillståndet in vivo jämfört med cellinjer. Dessa metoder ger också utredarna möjlighet att isolera och kultur stromaceller från olika kliniska och experimentella förhållanden, vilket gör jämförelser mellan grupper. Karaktäriserade esofagus stromaceller kan också användas i funktionella studier som undersöker epiteliala-stromal interaktioner i esofagus sjukdomar.
Introduction
Epitelceller-stromal interaktioner är involverade i regleringen av olika mag-tarmkanalen funktioner inklusive mucosal förnyelse, reparation, fibros och cancer 1,2. Dessa interaktioner har bäst studerade i tunntarmen och tjocktarmen och kan på liknande sätt spela en roll i esofagus slemhinnor sjukdomar 3. En subpopulation av intestinala och kolon stromaceller benämnda myofibroblaster har visats delta i mediering vävnadsskada, inflammation och reparera 4,5. I den distala magtarmkanalen, dessa spindelformade celler belägna intill basalmembranet vid gränssnittet mellan epitel och lamina propria och definieras som α-SMA och vimentin positivt, pan-cytokeratin negativ, och svagt positiv eller negativ desmin 5.
Esofagus stroma har inte rigoröst karakteriseras vid en cellulär eller molekylär nivå. Vårt arbete i murina matstrupen har frånmonstrated α-SMA och vimentin celler i matstrupen stroma, ibland underliggande till skivepitel 6. Epiteliala-stromala interaktioner har implicerats i esofageala mukosala störningar, såsom gastro-esofageal medierad skada 6 och eosinofil esofagit 3. Fibrotiska förträngningar är också en känd komplikation vid esofagus skador och stromaceller har varit inblandade i patogenesen för gastrointestinal fibros. Isolering av dessa celler kommer att hjälpa uppnå nödvändiga studier för att undersöka sinnesrubbat signalvägar.
Denna inlämning ger de tekniker som behövs för att fastställa primära kulturer av α-SMA positiva, vimentin positiva myofibroblaster så att befintliga kunskapsluckor när det gäller signalvägar som förmedlar dessa interaktioner kan åtgärdas. Den teknik som beskrivs har framgångsrikt använts av författarna att etablera primära murina colonic myofibroblaster 7 och further anpassad för etablering av murina 6 och mänskliga myofibroblast liknande esofagus stromaceller.
Häri beskriver vi förutsättningar för att etablera och karakterisera dessa kulturer etablerade från mus eller människa matstrupe före användning i framtida funktionella studier. Kulturer kan odlas och användas för upp vid 15 passager. Isolering och etablering av primära kulturer genom de metoder som beskrivs nedan genererar stromaceller med myofibroblast fenotyp; α-SMA, vimentin positiv och svagt positiv eller negativ för desmin och cytokeratin negativt. Denna fenotyp är distinkt från fenotypen av esofagus fibroblast som är övervägande vimentin positiv, α-SMA negativ tre eller α-SMA positiv, vimentin negativa fenotypen av muscularis mucosae 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknikerna för primär kultur generation är i allmänhet likartad när murina eller mänsklig vävnad med Kött och matsmältning tider anpassade för vävnadsstorlek. Vår erfarenhet med mus vävnad antyder att användning av de metoder som beskrivs ovan konsekvent leda lyckad etablering av primära kulturer. Kritiska steg inom protokollet omfattar sterilisering av kirurgisk utrustning och efter standardiserade sterila tekniker för vävnadsodling. Åldern på mössen är också ett kritiskt steg. 8-12 dagar gamla ny…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
