Udvikling af en<em> In vitro</em> Modelsystem til at studere interaktionen af<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE med sin højaffinitetsreceptoren FceRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
Allergi har været kendt i årtusinder. En astma behandling blev beskrevet i den gamle egyptiske medicinsk tekst kendt som Ebers Papyrus (~ 1550 fvt) og drøftet naturlægemidler at behandle det 7.
Dag allergi er klassificeret som en type I overfølsomhedsreaktion, hvor T hjælper celle type 2 (TH 2) arm af immunsystemet styrer produktionen af immunoglobulin E (IgE) antistoffer som reaktion på miljømæssige antigener kaldes allergener. Disse er forskellige stoffer, der almindeligvis interagerer med celler i immunsystemet og stimulere syntesen og sekretionen af pro-inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin-4 og interleukin-13 8, 9, som har partikler i cigaretrøg eller diesel udstødning partikler, der kan forbedre IgE-syntese 10.
Stigningen i allergiske manifestationer i de industrialiserede lande i de sidste 50 år er blevet tilskrevet en kombination af effekten afmiljøforurening og en tendens til en mere sminket miljø, der kombinerer at flytte immunrespons over en profil domineret af TH 2 cytokiner, som foreslået af "Hygiejne Hypotese« 11.
Som nævnt ovenfor, mennesker ikke er de eneste pattedyr, der lider af allergi. Navnlig heste og hunde kan også udvikle klassiske allergiske reaktioner og en undersøgelse af 12 har vist, at som hos mennesker, heste allergi tilskrives genetiske og miljømæssige faktorer. Som en konsekvens, præsentere gode modeller for at studere samspillet mellem genetiske og miljømæssige årsager til allergi, dens progression fra overfølsomhed over for sygdom, og mulige interventionsstrategier engang kliniske manifestationer har sat i disse dyr
I 1887 Stömmer var den første person til at beskrive ligheden mellem menneske og equin astma 13, virkningen af histamin på heste kardiovaskulære system ermeget ligner mennesker 14. Heste er også hjørnestenen i hestevæddeløb industrien, som er værd US 72 milliarder dollar med en betting omsætning på US 115 milliarder dollar årligt 15.
De fleste nutidige væddeløbsheste er efterkommere af det lille antal af araberheste opdrættet af Lady Anne Blunt fra 1878 og fremefter. Moderne væddeløbsheste er almindeligt indavlet til at vælge for ydeevne evner. De er tilbøjelige til genetiske sygdomme, hvoraf den ene er deres modtagelighed at montere allergiske reaktioner. De har også 1000 gange højere serum-IgE-niveauer end selv de hårdest allergiske mennesker 16. Horse allergiske reaktioner er normalt manifesterer sig som insektbid overfølsomhed (IBH) 17, 18. IBH resultater i dermatitis på grund af bid danner insekter i slægten Culicoides. En anden form for equin allergisk sygdom er tilbagevendende luftvejsobstruktioner (RAO), er dette udtryk i lunger og luftveje. Det er karakteriseret ved hvæsen og labORed vejrtrækning. RAO almindeligvis sker som reaktion på svampesporer, og er blevet registreret høje allergenspecifikke IgE-niveauer hos heste, der lider af RAO i en undersøgelse 19 selv om en anden undersøgelse har ikke bekræftet denne 20.
Undersøgelser equin allergi drejet omkring forsøg på overvågning og neutralisere heste IgE ved at udvikle anti-heste IgE monoklonale antistoffer (mAb'er) 21, 22. Endvidere undersøgelsen med 23 diskuterer fremstillingen af de ekstracellulære domæner af heste- høj affinitet Fc receptors α kæde (FcERla) receptoren i et forsøg på at detektere og kvantificere equin serum IgE. En beslægtet undersøgelse af Ledin 24 diskuterer en ny tilgang med henblik på at neutralisere serum IgE ved priming immunforsvaret ved hjælp af en selv / ikke-selv immunogen. Alle disse undersøgelser har imidlertid manglet en effektiv assay til at teste sikkerheden og effektiviteten af deres protokoller. I denne artikel præsenterer vi nu sådan analyse system, der gælder for studiet af diagnostiske og terapeutiske strategier er relevante for heste-systemet, hvor β-hexosaminidase release, som en indikator for celle mediator degranulation, blev vurderet på RBL-2H3.1 celler, der udtrykker equin FcERla. Denne protokol er baseret på tidligere publikationer 25, 4, 5, 2, 3 beskriver konstruktionen af RBL-celler transficeret med det gen, der koder for det IgE-bindende domæne af højaffinitetsreceptoren for IgE fra forskellige arter. Protokollen forklarer, hvordan man udfører en β-hexosaminidase release assay, hvis resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af tredobbelte eksperimenter.
Frigivelsen assay blev først udviklet af Siraganian og Hook 25 for at studere menneskelig allergi. Laboratoriet gruppe ledet af Dr. Reuben Siraganian også udviklet RBL cellelinje. Disse RBL-celler blev udviklet til at udtrykke den menneskelige FcERla og protokollen blev offentliggjort af 4. Den sidste brikaf assayet kom med udviklingen af pSV plasmid i papiret ved Neuberger 26, som beskrev fremstillingen af en IgE-antistoffer ved kloning af sin tunge kæde gen nedstrøms for en mus gen for en IgE variabel region, der er rettet mod haptenet 4-hydroxy-3 nitro-phenacetyl (NP), den resulterende kimære antistof var fuldt funktionsdygtig. Evnen til at udvikle nogen IgE rettet mod samme hapten, samtidig kloning dens receptor på overfladen af RBL-celler resulterede i standardisering af analysen gør det til et nyttigt protokol til måling af degranulering af basofile celler.
Assayet ikke har fordele og ulemper. Professionelle af analysen er dets tilpasningsevne, der skal anvendes i en hvilken som helst pattedyr-systemet har vores laboratorium således anvendes det til at teste for degranulering i mennesker, hunde og heste systemer, og det er muligt blot ved at syntetisere organismens IgE og kloning dets receptor på overfladen af RBL-celler.
På den anden side,ulemper ved assayet er, at RBL-celler er meget følsomme over for termisk, mekanisk og pH-ændringer, hvilket gør dem give en variation af degranulering niveauer inden for samme assay. Det er således anbefales, at analyserne altid gentages i tre eksemplarer, og derefter et gennemsnit er taget fra dem. Endvidere RBL-celler tendens til at flytte mod en ikke-frigørende fænotype, hvis de efterlades i vævskultur i en længere tid (> 10 uger) 27, hvilket gør deres vedligeholdelse besværlig. De er også udsat for infektioner med Mycoplasma bakterier, som ikke er synlige fra et lysmikroskop og ikke ændrer cellens morfologi, men ville drastisk ændre deres degranulering niveauer. Således er der behov for regelmæssig mycoplasma tests.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenfattende resultaterne af denne undersøgelse viste, at når RBL-2H3.1 celler, der udtrykker hestefamilien FcERla er sensibiliseret med equin IgE og udfordret af et antigen, de giver et højdepunkt mediatorfrigivelse på 36,68% ± 4,88% af den samlede mængde af mediator indeni celler, sammenlignet med RBL-2H3.1 parentale celler som ikke udtrykker equin FcERla.
Således denne analyse giver et nyttigt redskab til at undersøge og studere hestesygdomme allergiske reaktioner in vitro.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
References
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. . Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The ‘hygiene hypothesis’ for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of ‘Broken Wind’ in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , (2010).
- Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
