Développement d'un<em> In vitro</em> Système modèle pour l'étude de l'interaction de<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE avec son récepteur de haute affinité FcsRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
Allergie est connue depuis des millénaires. Un traitement de l'asthme a été décrit dans le texte médical égyptien antique connu sous le papyrus Ebers (~ 1550 avant notre ère) et discuté remèdes pour traiter 7.
allergie est aujourd'hui considéré comme une réponse d'hypersensibilité de type I, où le type T cellulaire auxiliaire 2 (TH 2) du bras du système immunitaire dirige la production d'immunoglobulines E (IgE), des anticorps en réponse à des antigènes environnementaux appelés allergènes. Ce sont diverses substances qui interagissent couramment avec les cellules du système immunitaire et stimuler la synthèse et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, y compris l'interleukine-4 et l'interleukine-13, 8, 9 comme ne particules dans les particules de fumée de cigarette ou diesel échappement qui augmente la synthèse des IgE 10.
La hausse des manifestations allergiques dans les pays industrialisés au cours des 50 dernières années a été attribué à une combinaison de l'effet depolluants de l'environnement et une tendance à un environnement plus aseptisé, qui se combinent pour décaler la réponse immunitaire vers un profil prédominé par Th 2 cytokines, telle que proposée par la 'hypothèse hygiénique »11.
Comme mentionné ci-dessus, l'homme ne sont pas les seuls mammifères affligés par une allergie. Notamment les chevaux et les chiens peuvent aussi développer des réactions allergiques classiques et une étude de 12 a montré que, comme chez les humains, l'allergie équin est attribuée à des facteurs génétiques et environnementaux. En conséquence, ces animaux présentent de bons modèles pour étudier l'interaction entre les facteurs génétiques et environnementaux de l'allergie, la progression de la sensibilisation à la maladie et les stratégies d'intervention possibles une fois les manifestations cliniques sont fixés dans
En 1887, Stömmer était la première personne pour décrire la similitude entre l'homme et l'asthme équine 13, l'effet de l'histamine sur le système cardio-vasculaire équine esttrès similaire à celui des humains 14. Les chevaux sont aussi la pierre angulaire de l'industrie des courses de chevaux, qui vaut 72 milliards de dollars, un chiffre d'affaires de paris de 115 milliards de dollars par an 15.
La plupart des chevaux de course contemporains sont des descendants du petit nombre de chevaux arabes élevés par Lady Anne Blunt à partir de 1878. Chevaux de course modernes sont souvent consanguins à sélectionner pour les capacités de performance. Ils sont sujets à des troubles génétiques, dont l'un est leur susceptibilité à monter des réponses allergiques. Ils ont aussi 1000 fois plus élevés que les niveaux d'IgE sériques même les êtres humains plus sévèrement allergique 16. réactions allergiques à cheval sont se manifeste habituellement par une hypersensibilité insecte morsure (IBH) 17, 18. IBH résultats dans des dermatoses dues aux piqûres d'insectes forment dans le genre Culicoides. Une autre forme de la maladie allergique équine est obstructions des voies respiratoires récurrentes (RAO), cela se manifeste dans les poumons et les voies respiratoires. Elle est caractérisée par une respiration sifflante et laboratoirerespiration ORed. RAO se produit généralement en réponse à spores de moisissures, et des niveaux élevés d'IgE spécifiques des allergènes ont été enregistrés chez les chevaux atteints de RAO dans une étude 19 mais une autre enquête n'a pas confirmé cette 20.
Des études sur l'allergie équine ont tourné autour de l'essai de contrôle et de neutraliser équine IgE par le développement d'anticorps anti-équin IgE monoclonal (mAb) 21, 22. En outre, l'étude de 23 traite de la production de domaines extracellulaires de l'α de l'équin haute affinité Fc récepteur chaîne (FcεRIα) récepteur dans le but de détecter et de quantifier le sérum équin IgE. Une étude connexe par Ledin 24 traite d'une nouvelle approche visant à neutraliser les IgE sériques en amorçant le système immunitaire en utilisant un auto / non-soi immunogène. Toutes ces études, cependant, manquait un dosage efficace pour tester l'innocuité et l'efficacité de leurs protocoles. Dans cet article, nous présentons un tel sys d'essaisystème applicable à l'étude des stratégies diagnostiques et thérapeutiques pertinentes pour le système équin, où β-hexosaminidase libération, comme un indicateur de médiateur de la dégranulation cellulaire, a été évaluée sur des cellules RBL-2H3.1 exprimant FcεRIα équine. Ce protocole est basé sur des publications antérieures 25, 4, 5, 2, 3, décrivant l'ingénierie de cellules RBL transfectées avec le gène codant le domaine de liaison du récepteur IgE de haute affinité pour les IgE provenant d'espèces différentes. Le protocole explique comment effectuer un test de libération de β-hexosaminidase, dont les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type d'expériences en triple.
Le dosage de la libération a été développé par Siraganian et le crochet 25 pour étudier allergie humaine. Le groupe de laboratoire dirigé par le Dr Reuben Siraganian également développé la lignée cellulaire RBL. Ces cellules RBL ont été développés pour exprimer la FcεRIα humain et le protocole a été publié par 4. La dernière piècedu dosage fournie avec le développement du plasmide pSV dans le papier par Neuberger 26 qui décrit la production d'un anticorps IgE par clonage de son gène de chaîne lourde en aval d'un gène de la souris pour une région variable d'IgE qui cible l'haptène 4-hydroxy-3 nitro-phénacétyle (NP), l'anticorps chimérique résultant était pleinement fonctionnel. La possibilité de développer tout IgE ciblant le même haptène, tout en clonant son récepteur sur la surface des cellules RBL abouti à la normalisation du dosage qui en fait un protocole utile pour mesurer la dégranulation des basophiles.
Le test a des avantages et des inconvénients. Les avantages du dosage est son adaptabilité à être utilisé dans un système de mammifère, notre laboratoire a ainsi utilisé pour tester la dégranulation dans les systèmes humains, canins, équins, ce qui est réalisable simplement par synthèse d'IgE de l'organisme et le clonage de son récepteur sur la surface des cellules RBL.
D'autre part,les inconvénients de l'essai est que les cellules RBL sont très sensibles aux variations thermiques, mécaniques et PH, ce qui leur donne une variation des niveaux de dégranulation au sein de la même dosage. Il est donc fortement conseillé que les essais sont toujours répétées en triple, puis en prenant la moyenne de leur part. En outre, les cellules RBL ont tendance à se déplacer vers un phénotype non-libération si elles sont laissées en culture de tissu pendant des périodes prolongées (> 10 semaines) 27, ce qui rend leur entretien lourd. Elles sont également sujettes à des infections par des bactéries de mycoplasmes, qui ne sont pas visibles à partir d'un microscope optique et ne modifient pas la morphologie de la cellule, mais cela changerait radicalement leurs niveaux de dégranulation. Ainsi des tests réguliers de mycoplasmes sont nécessaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
En résumé, les résultats de cette enquête ont montré que lorsque les cellules RBL-2H3.1 exprimant FcεRIα équins sont sensibilisées avec équine IgE et remis en cause par un antigène, ils donnent un pic de libération de médiateur de 36,68% ± 4,88% du montant total de médiateur à l'intérieur du cellules, par rapport à la RBL-2H3.1 cellules parentales non exprimant équine FcεRIα.
Ainsi, ce test fournit un outil utile pour étudier et étudier les réponses allergiques é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
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