एक का विकास<em> इन विट्रो</emकी बातचीत के अध्ययन के लिए> मॉडल प्रणाली<em> ऐकव्स</em><em> Caballus</emइसकी उच्च आत्मीयता रिसेप्टर FcεRI साथ> आईजीई
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
एलर्जी सदियों के लिए जाना जाता रहा है. अस्थमा के उपचार Ebers Papyrus (~ 1550 ईसा पूर्व) के रूप में जाना जाता है प्राचीन मिस्र के चिकित्सा पाठ में वर्णित है और यह 7 के इलाज के लिए हर्बल उपचार पर चर्चा की गई.
आज एलर्जी टी सहायक सेल टाइप 2 (वीं 2) प्रतिरक्षा प्रणाली के हाथ एलर्जी कहा जाता पर्यावरण एंटीजन के जवाब में इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) एंटीबॉडी के उत्पादन steers जहां एक प्रकार मैं अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया, के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. ये आमतौर प्रतिरक्षा प्रणाली में कोशिकाओं के साथ बातचीत और आईजीई संश्लेषण सिगरेट का धुआँ या डीजल निकास कण कण में बढ़ाने के जो रूप में इंटरल्यूकिन -4 और इंटरल्यूकिन 13 8, 9 सहित संश्लेषण और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को उत्तेजित कि विविध पदार्थ हैं 10.
पिछले 50 वर्षों में औद्योगिक देशों में एलर्जी अभिव्यक्तियों में वृद्धि के प्रभाव के संयोजन के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है'स्वच्छता परिकल्पना' 11 द्वारा प्रस्तावित वें 2 साइटोकिन्स द्वारा predominated एक प्रोफाइल की ओर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शिफ्ट करने के लिए गठबंधन जो पर्यावरण प्रदूषण और एक अधिक साफ पर्यावरण के लिए एक प्रवृत्ति,.
जैसा कि ऊपर कहा, मनुष्य एलर्जी से पीड़ित केवल स्तनधारियों नहीं हैं. उल्लेखनीय है कि घोड़े और कुत्ते भी क्लासिक एलर्जी प्रतिक्रियाओं विकसित कर सकते हैं और, घोड़े एलर्जी आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों को जिम्मेदार ठहराया है मनुष्य के रूप में 12 के एक अध्ययन, पता चला है कि. एक परिणाम के रूप में, इन जानवरों के एक बार नैदानिक अभिव्यक्तियाँ में निर्धारित किया है एलर्जी की आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारणों, बीमारी को संवेदनशील बनाने से इसकी प्रगति, और संभव हस्तक्षेप रणनीतियों के बीच परस्पर क्रिया के अध्ययन के लिए अच्छा मॉडल पेश
1887 में, Stömmer, घोड़े का हृदय प्रणाली पर हिस्टामिन का प्रभाव है मानव और घोड़े अस्थमा 13 के बीच समानता का वर्णन करने के पहले व्यक्ति थेमनुष्यों 14 की है कि बहुत समान. घोड़े भी 15 सालाना $ 115000000000 अमेरिका की एक शर्त के कारोबार के साथ लायक अमेरिका $ 72000000000 है जो घुड़दौड़ उद्योग की आधारशिला हैं.
सबसे समकालीन racehorses के बाद 1878 से लेडी ऐनी ब्लंट द्वारा नस्ल अरब घोड़ों की छोटी संख्या के वंशज हैं. आधुनिक racehorses सामान्यतः प्रदर्शन क्षमताओं के लिए चयन करने के लिए सहज रहे. वे एलर्जी प्रतिक्रियाओं माउंट करने के लिए अपनी संवेदनशीलता है, जिनमें से एक आनुवंशिक विकार, से ग्रस्त हैं. उन्होंने यह भी भी सबसे गंभीर एलर्जी मनुष्य के 16 की तुलना में 1000 गुना अधिक है सीरम आईजीई स्तर है. हार्स एलर्जी प्रतिक्रियाओं आमतौर पर कीड़े के काटने अतिसंवेदनशीलता (IBH) 17, 18 के रूप में प्रकट होते हैं. कारण काटने के लिए जिल्द की सूजन में IBH परिणाम जीनस Culicoides में कीड़ों के रूप में. घोड़े एलर्जी रोग का दूसरा रूप आवर्तक वायु-मार्ग अवरोधों (राव), यह फेफड़ों और वायुमार्ग में प्रकट होता है है. यह घरघराहट और प्रयोगशाला की विशेषता हैored साँस लेने में. राव सामान्यतः बीजाणुओं मोल्ड करने के लिए प्रतिक्रिया में होता है, और किसी अन्य जांच इस 20 पुष्टि नहीं की है, हालांकि उच्च allergen के-विशिष्ट IgE का स्तर एक अध्ययन 19 में राव से पीड़ित घोड़ों में दर्ज किया गया है.
घोड़े एलर्जी पर अध्ययन प्रयास निगरानी में और विरोधी घोड़े का आईजीई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (Mabs) 21, 22 के विकास के द्वारा घोड़े का आईजीई को निष्क्रिय करने के चारों ओर घूमती है. इसके अलावा 23 से अध्ययन घोड़े का उच्च आत्मीयता एफसी रिसेप्टर के α की बाह्य डोमेन के उत्पादन की चर्चा घोड़े सीरम आईजीई का पता लगाने और quantitate करने की कोशिश में श्रृंखला (FcεRIα) रिसेप्टर. Ledin 24 से संबंधित एक अध्ययन में एक आत्म / गैर आत्म immunogen का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली को भड़काना द्वारा सीरम आईजीई को निष्क्रिय करने के उद्देश्य से एक नया दृष्टिकोण पर चर्चा. इन सभी अध्ययनों, हालांकि, उनके प्रोटोकॉल की सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए एक प्रभावी परख का अभाव है. इस अनुच्छेद में, हम अब इस तरह के एक परख व्यवस्था पेशβ-hexosaminidase रिहाई, सेल मध्यस्थ degranulation का एक संकेतक के रूप में, घोड़े FcεRIα व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं पर मूल्यांकन किया गया था जहां घोड़े प्रणाली, के लिए प्रासंगिक नैदानिक और चिकित्सीय रणनीतियों के अध्ययन के लिए लागू मंदिर. इस प्रोटोकॉल विभिन्न प्रजातियों से आईजीई के लिए उच्च आत्मीयता रिसेप्टर की आईजीई बाध्यकारी डोमेन एन्कोडिंग जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट आरबीएल कोशिकाओं के इंजीनियरिंग वर्णन पिछले प्रकाशनों 25, 4, 5, 2, 3 पर आधारित है. प्रोटोकॉल, जिनमें से परिणाम तीन प्रतियों प्रयोगों का मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं एक β-hexosaminidase रिहाई परख प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें.
रिहाई परख पहले Siraganian द्वारा विकसित की है और मानव एलर्जी के अध्ययन के लिए 25 हुक गया था. डॉ रूबेन Siraganian के नेतृत्व में प्रयोगशाला समूह भी आरबीएल सेल लाइन विकसित की है. ये आरबीएल कोशिकाओं मानव FcεRIα व्यक्त करने के लिए विकसित किए गए और प्रोटोकॉल 4 द्वारा प्रकाशित किया गया था. अंतिम टुकड़ापरख 4–हाइड्रोक्सी 3 hapten कि लक्ष्य एक आईजीई चर क्षेत्र के लिए एक माउस जीन के बहाव इसकी भारी श्रृंखला जीन क्लोनिंग से एक IgE एंटीबॉडी का उत्पादन वर्णित जो Neuberger 26 से अखबार में पीएसवी प्लाज्मिड के विकास के साथ आया की नाइट्रो-phenacetyl (एनपी), जिसके परिणामस्वरूप काइमेरिक एंटीबॉडी पूरी तरह कार्यात्मक था. भी यह बेसोफिल कोशिकाओं के degranulation को मापने के लिए एक उपयोगी प्रोटोकॉल बना परख के मानकीकरण में हुई आरबीएल कोशिकाओं की सतह पर अपने रिसेप्टर क्लोनिंग जबकि क्षमता, वही hapten को लक्षित किसी भी आईजीई विकसित करने के लिए.
परख भला और बुरा है. परख के पेशेवरों, हमारी प्रयोगशाला इस प्रकार मानव, कुत्ते और घोड़े प्रणालियों में degranulation के लिए परीक्षण करने के लिए इसका इस्तेमाल किया गया है किसी भी स्तनधारी प्रणाली में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अपने अनुकूलन क्षमता है, और यह बस जीव के आईजीई synthesizing और इसके रिसेप्टर क्लोनिंग द्वारा प्राप्त है आरबीएल कोशिकाओं की सतह पर.
दूसरी ओर,परख का बुरा आरबीएल कोशिकाओं उन्हें एक ही परख भीतर degranulation स्तरों के विभिन्नता दे, जिससे थर्मल, यांत्रिक और पीएच परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील हैं. यह इस प्रकार दृढ़ता से assays के हमेशा triplicates में दोहराया जाता है और फिर एक औसत उन लोगों से लिया जाता है कि सलाह दी है. इसके अलावा, आरबीएल कोशिकाओं वे उनके रखरखाव बोझिल बना रही है, एक विस्तारित टाइम्स (> 10 सप्ताह) 27 के लिए टिशू कल्चर में छोड़ दिया जाता है अगर एक गैर रिहा फेनोटाइप की ओर शिफ्ट करने के लिए करते हैं. उन्होंने यह भी एक प्रकाश माइक्रोस्कोप से दिखाई नहीं हैं और सेल की आकृति विज्ञान बदल नहीं है जो माइकोप्लाज्मा बैक्टीरिया से संक्रमण, से ग्रस्त हैं, लेकिन काफी उनके degranulation का स्तर बदल जाएगा. इस प्रकार नियमित माइकोप्लाज्मा परीक्षण की जरूरत है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सारांश में इस जांच के परिणाम घोड़े का FcεRIα व्यक्त आरबीएल-2H3.1 कोशिकाओं एक प्रतिजन द्वारा घोड़े का आईजीई के साथ अवगत और चुनौती दी है, वे अंदर मध्यस्थ की कुल राशि का 4.88% ± 36.68% की एक चोटी मध्यस्थ रिहाई दे कि पता चल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
References
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