Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
من أجل توليد أعداد كبيرة من الخلايا البشرية قابلة للحياة وظيفية للزرع، وتنظيم شروط الثقافة أمر حتمي. استنزاف المواد المغذية، جنبا إلى جنب مع تراكم النفايات الأيضية والمساهمين الرئيسيين في الشيخوخة والتغييرات الأيضية التي تقلل من جودة المنتج الخلية 1-3. يوضح هذا الإجراء وسيلة لخلايا الثدييات الثقافة في الكروية باستخدام مفاعل حيوي أثار جنبا إلى جنب مع نظام تغذية معدل نضح المعدل لتنظيم الجلوكوز في مجموعة الفسيولوجية 4 طوال مدة الثقافة. لغرض هذه الدراسات، تم تعريف نطاق الفسيولوجية كما بين 100 و 200 ملغ / دل. الأساليب نفسها يمكن استخدامها لتنظيم المواد المغذية الأخرى والنفايات الأيضية مثل اللاكتات.
وتستخدم – (30 مل 1) عادة في إعداد مختبر للحفاظ على وتمييز خطوط الخلايا لexperime الثقافات ثابتة في أحجام صغيرةأغراض ntal. يتم تنفيذ الركض الخلايا مع التغيرات المتوسطة كاملة حسب الحاجة، على فترات منتظمة. معظم "التقليدية" مستنبت يحتوي على نسبة الجلوكوز المرتفع (450 ملغ / دل لDMEM المستخدمة في هذه الدراسات) للسماح للتغييرات متوسطة أقل تواترا دون التعرض لخطر القيود الغذائية. ومع ذلك، وهذه الطريقة الرضاعة دفعة لا يزال يتطلب التلاعب المتكرر، ويدخل التغير في البيئة الخلايا، ويزيد من خطر التلوث 5-9. المفاعلات الحيوية تعليق أثار (SSB) تقدم أفضل خلط وانخفض التعامل مع 3،10 – 20، ولكن مثل الثقافات ثابتة، سوف يتطلب تغييرات المتوسطة اليدوية التي تسهم في التقلبات الضارة المحتملة في مستويات المنتجات الغذائية والنفايات. التغذية نضح من الثقافات SSB يقلل تبقى هذه المشاكل عن طريق التسريب المستمر وإزالة المتوسطة، ولكن تغييرات كبيرة في مستويات المواد الغذائية بسبب نمو الخلايا قضية. استخدام وسيلة را التغذية المعدلالشركة المصرية للاتصالات من حسابات استخدام المواد الغذائية على أساس الاحتياجات خلية يقدر يمكن أن توفر بيئة مستقرة الخلية المطلوبة لتحسين بقاء الخلية وتعمل 21-24.
وهناك مجموعة كبيرة من المؤلفات التي تصف طرق للثقافات SSB قابلة للخلايا الثدييات على وجه التحديد للثقافة والتوسع في الخلايا المحفزة 25 – 32، مع الآخرين تركز على جزيرة (بيتا) خلايا 17،33،34، أو إنتاج المنتجات البيولوجية 24، 35-38. العديد من هذه الأنواع خلية التحقيق قد نمت في الثقافات كروي، ويجب أن يكون الأمثل إجراءات محددة لنوع من الخلايا المستخدمة قبل تطبيق نظام التغذية المستمر. في هذه المظاهرة، واستخدمت طريقة التغذية نضح لتوسيع خط خلايا بيتا كما نمت الكروية في مفاعل حيوي أثار 39-43. الطريقة الموصوفة هنا يوفرتنفيذ مباشر لتغذية تعديلات سعر استنادا إلى قياسات الجلوكوز خارج الشبكة لتحقيق الظروف والثقافة المستهدفة. ضبط معدل التغذية مع هذه الطريقة للحفاظ يظهر مستوى الجلوكوز الفسيولوجية لعائدات الخلوي الزيادات. خلايا الثدييات هي التي تعتمد على المواد الغذائية الرئيسية، والجلوكوز، لإنتاج الطاقة، وبالتالي فإن استخدام هذا الخط الخلية يمثل نموذجا للعديد من خلايا الثدييات مثقف 44. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الخط مثالا على تعقيد مزيد من خلايا بيتا، التي تعتبر حساسة لمستويات عالية مزمنة من الجلوكوز 45. لهذه الدراسة، تم السماح للخلايا β TC6 لتشكيل الأجسام الشبه الكروية في الثقافة لتقريب متوسط حجم الجزر لانجرهانز في الجسم الحي. نظام مفاعل حيوي نضح 17 – 19،21،46 مع معدل التغذية تعديلها لالجلوكوز الاستهلاك، أدى في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية وعوائد الخلية أعلى من دون تغيير في قدرتها على البقاء.
توليد منتجات خلايا الثدييات لإنتاج العوامل البيولوجية ولعلاجات الخلايا يتطلب ثقافة ورصد خلايا الثدييات في نطاق واسع 55-58. وعلاوة على ذلك، تدعو هذه التطبيقات لظروف ثقافة محددة والتحقق من صحتها. ببساطة زيادة حجم الخلايا باستخدام تقنيات الأبحاث لن تل?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |