Candida Albicans биопленки развития на медицинской актуальных инородных тел в мышиной подкожной модели с последующим биолюминесценции изображений
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
Candida развитие Albicans биопленки на биотических и / или абиотических поверхностях представляет определенную угрозу для госпитализированных пациентов. До сих пор, C. альбиканс биопленки были изучены преимущественно в пробирке, но есть острая потребность для лучшего понимания этого динамичного процесса в условиях естественных. Мы разработали подкожный крысиной модели в естественных условиях для изучения С формирование Albicans биопленки. В нашей модели множественного (до 9) Candida -infected устройства имплантируют в задней части животного. Это дает нам большое преимущество над центральным венозным катетером модельной системы, так как позволяет нам изучать несколько независимых биопленки в одном животного. В последнее время мы адаптировали эту модель для изучения С развитие биопленки Albicans в BALB / C мышей. В этой модели, зрелые С альбиканс биопленки развиваются в течение 48 ч и демонстрируют типичное трехмерное архитектуры биопленки. Количественное грибковой биопленкитрадиционно анализируются после смерти и требует хоста жертвы. Поскольку это требует использования многих животных для выполнения кинетических исследований, мы использовали неинвазивный биолюминесценции изображений (BLI), чтобы следовать в продольном направлении в естественных условиях зрелых С Albicans биопленки развития в нашей подкожной модели. С альбиканс клетки, сконструированные для экспрессии гена принцепс люциферазы Gaussia (Gluc), прикрепленный к клеточной стенке. Сигнал биолюминесценции получают путем люциферазы, который преобразует дополнительное подложки коэлентеразина в свет, который может быть измерен. Сигнал BLI напоминал количества клеток, полученных из эксплантированных катетеров. Неинвазивная визуализация для количественной оценки в формировании естественных биопленки обеспечивает немедленную приложения для скрининга и подтверждения противогрибковых препаратов в условиях естественных условиях, а также для исследований, основанных на хозяин-патоген взаимодействий, настоящим способствует лучше понятьчисле патогенеза катетер ассоциированных инфекций.
Introduction
Candida Albicans является синантропных организма, которые могут быть найдены в различных местах здоровых лиц, например на кожу или в виде части желудочно-кишечного тракта и вагинальной флоры. Тем не менее, в больницу, и особенно у пациентов с иммунодефицитом, это может привести к широкий спектр инфекций 1. В таких лиц, ослабленная иммунная система позволяет Candida клеток для распространения в кровоток и вторгнуться глубокие ткани, вызывая угрожающих жизни инфекций. Кроме того, присутствие абиотических субстратов, таких как центрального венозного и мочевых катетеров, искусственных клапанов сердца и суставов могут служить ниши для крепления Candida 2. Адгезия к таким субстратов является необходимым условием для дальнейшего развития биопленки, которая представляет собой слой дрожжей и гиф клеток, встроенных в внеклеточной полимерного материала, в основном состоящий из полисахаридов 2. C. альбиканс катетер -associated инфекциисвязаны с высокой смертностью. Общая характеристика биопленки является их снижения чувствительности к известным противогрибковые препараты, такие как азолов 3,4. Только новые классы противогрибковых препаратов, таких как эхинокандинов и липосомальной композиции амфотерицина оказался активным против катетер-ассоциированной инфекции 5-7. Из-за биопленки устойчивости к противогрибковые препараты, лечебные подходы являются весьма ограниченными, что часто приводит к удалению катетера и его последующей заменой в качестве единственного решения.
Большинство нашего нынешнего понимания С. развитие Albicans биопленки происходит от в пробирке исследования на абиотических субстратов, таких как полистирол или пластмасс, используемых для изготовления вышеуказанных устройств, т.е., силикона, полиуретана 2. Эти модели являются весьма прогрессивным и попытаться имитировать ситуацию в естественных условиях, насколько это возможно. Тем не менее, эти системы не связаны с непрерывным потоком крови и тон иммунная система хозяина. Это привело к разработке систем в естественных условиях модели, такие как центральный венозный катетер (CVC) модели 8-10 протеза стоматита модели кандидоза полости рта 11 и мышиной модели для катетер-ассоциированной кандидурия 12. Кроме того, С. Развитие Albicans биопленки изучали на крысах на поверхности слизистых оболочек, таких как те, из влагалища 13 и полости рта 14. Наша лаборатория вклад с созданием подкожного С Albicans биопленки модель, которая основана на имплантат зараженных катетер частей на задней Sprague Dawley крыс 15. Эта модель была успешно использована в нашей лаборатории, чтобы проверить биопленки восприимчивость к флуконазолу и эхинокандин наркотики 5,16, для изучения влияния комбинаторной терапии диклофенака и каспофунгином 17. Совсем недавно мы адаптированы этой системы для использования в линии BALB / C мышей 18,19. Впо сравнению с другими в моделях естественных условиях, главным преимуществом этого подкожной модели возможность учиться несколько биопленки на одно животное, разработанной внутри просвета имплантированных катетер штук.
Чтобы уменьшить количество лабораторных животных, мы адаптировали эту модель для изучения развития C. Albicans биопленки неинвазивным путем использования биолюминесценции томография (BLI) 18,19. Этот метод оказался мощный метод, который может быть использован для количественного биопленки путем измерения определенный сигнал BLI в интересующей области (в нашем случае площадь имплантированных катетеров), избегая жертву животных. По сравнению с бактериями, которое можно выразить как ген и подложки, необходимое для проведения реакции биолюминесценции в связи с введением определенного лк оперона 20 большинство из эукариотических организмов, в том числе С Albicans, зависит от гетерологичной экспрессии гена люциферазы в сочетании сВнешний введение специфического субстрата, такого как D-люциферин или коэлентеразина 21. Возможно из-за присутствия грибковых клеточной стенки и С. Albicans морфогенез, внутриклеточной доставки субстрата для фермента люциферазы был основной проблемой 21. Для того чтобы решить эту проблему, Enjalbert др. 22 инженерии штамм, где синтетический С. Albicans кодон-оптимизированная версия гена естественно, выделяемой Gaussia принцепса люциферазы (Gluc) был присоединен к к С. Ген Albicans PGA59, GPI- якорь белок клеточной стенки. Из-за присутствия люциферазы в клеточных стенок, проблемы, связанные с внутриклеточной доступности субстрата можно было бы избежать. Это особая система была использована для изучения поверхностных инфекций, вызванных C. Albicans 22. Совсем недавно, BLI был также использован, чтобы следовать прогрессирование орофарингеального кандидоза и его possiblе лечение 23. Такие выводы поддерживают использование BLI как перспективный метод для изучения инфекций, вызванных свободно живущих клеток, но также устройств, ассоциированных инфекций.
В этом исследовании мы описываем С развитие биопленки Albicans на полиуретановой катетер штук в линии BALB / C мышей и ее количественного описания с использованием BLI. Мы предлагаем подробный протокол колонизации в пробирке полиуретановых катетеров в период адгезии с последующим имплантации у мышей и последующего развития биопленки в живых животных. Помимо измерения сигнала BLI излучаемого С альбиканс клетки мы также определить колониеобразующих единиц для сравнения со стандартным техники для нагрузки количественной биопленки грибковой,
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование моделей животных, и особенно грызунов моделей, для исследования, посвященные микробных биопленок очень важно, так как иммунная система хозяина является существенным фактором в формировании биопленки, что модели в пробирке не может объяснить. В этом исследовании мы …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
