We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Candida albicans biofilm ontwikkeling op biotische en / of abiotische vlakken vormt een specifieke dreiging voor gehospitaliseerde patiënten. Tot nu toe C. albicans biofilms werden voornamelijk bestudeerd in vitro, maar er is een dringende behoefte aan een beter begrip van deze dynamische proces onder in vivo condities. We ontwikkelden een in vivo subcutane rat model om C. te studeren albicans biofilm vorming. In ons model meervoudige (tot 9) Candida geïnfecteerde inrichtingen worden geïmplanteerd om het rugdeel van het dier. Dit geeft ons een groot voordeel ten opzichte van de centrale veneuze katheter modelsysteem als het ons toelaat om verschillende onafhankelijke biofilms studeren in één dier. Onlangs hebben we aangepast deze model naar C. studeren albicans biofilm ontwikkeling in BALB / c muizen. In dit model, volwassen C. albicans biofilms ontwikkelen binnen 48 hr en tonen de typische driedimensionale biofilm architectuur. Het kwantificeren van schimmels biofilmis van oudsher geanalyseerd post mortem en vereist gastheer opoffering. Omdat dit vereist het gebruik van vele dieren kinetische studies uitvoeren, toegepast worden niet-invasieve bioluminescentie (BLI) longitudinaal volgen in vivo volwassen C. albicans biofilms ontwikkelen in onze subcutane model. C. albicans cellen werden om de Gaussia princeps luciferasegen (GLUC) bevestigd aan de celwand expressie. De bioluminescentie-signaal wordt geproduceerd door het luciferase die het toegevoegde substraat coelenterazine omzet in licht die kan worden gemeten. De BLI signaal leek cel verkregen uit geëxplanteerde katheters telt. Niet-invasieve beeldvorming voor het kwantificeren van in vivo biofilmvorming biedt onmiddellijke toepassingen voor screening en validatie van antimycotica onder in vivo omstandigheden, alsmede voor studies op basis van gastheer-pathogeen interacties hierbij dragen tot een beter begriping van de pathogenese van katheter-gerelateerde infecties.
Candida albicans is een commensaal organisme, te vinden op verschillende plaatsen van gezonde individuen, bijvoorbeeld op de huid of als een deel van de tractus en vaginale flora. Echter, in het ziekenhuis, en vooral immunogecompromitteerde patiënten, kan een groot aantal infecties 1 veroorzaken. Bij dergelijke individuen, het verzwakte immuunsysteem maakt Candida cellen te verspreiden in de bloedbaan en diepere weefsels binnen te vallen waardoor levensbedreigende infecties. Bovendien is de aanwezigheid van abiotische substraten zoals centrale veneuze en urinaire katheters, kunstmatige hartkleppen en gewrichten kunnen een niche voor Candida bevestiging 2 verschaffen. Hechting aan dergelijke substraten is voordat verder biofilm ontwikkeling, waarop een laag gist en hyphal cellen ingebed in extracellulair polymeermateriaal vertegenwoordigt hoofdzakelijk uit polysacchariden 2. C. albicans katheter-geassocieerde infectiesworden geassocieerd met een hoog sterftecijfer. Een algemeen kenmerk van biofilms is hun verminderde gevoeligheid voor bekende antimycotica, zoals azolen 3,4. Alleen nieuwere klassen van antimycotica, zoals echinocandinen en liposomale formulering van amfotericine B bleken werkzaam tegen katheter infecties 5-7 zijn. Door biofilm veerkracht antimycotica zijn therapeutische benaderingen erg beperkt, wat vaak leidt tot verwijdering van de katheter en de daaropvolgende vervanging als enige oplossing.
De meeste van onze huidige kennis van C. albicans biofilm ontwikkelen komt uit in vitro naar abiotische substraten zoals polystyreen, of kunststof voor de vervaardiging van bovengenoemde inrichtingen, bijvoorbeeld, silicone, polyurethaan 2. Deze modellen zijn zeer geavanceerd en proberen de situatie in vivo zo goed mogelijke nabootsen. Echter, deze systemen niet betrekking op de continue bloedstroom en thij immuunsysteem van de host. Dit resulteerde in de ontwikkeling van in vivo modelsystemen, zoals centrale veneuze katheter (CVC) model 8-10, de prothese stomatitis model van orale candidiasis 11 en een muizenmodel voor katheters candidurie 12. Bovendien, C. albicans biofilm ontwikkeling werd bestudeerd in vivo op de mucosale oppervlakken, zoals die van de vagina 13 en mondholte 14. Ons laboratorium heeft bijgedragen aan de oprichting van een onderhuidse C. albicans biofilm model, dat is gebaseerd op het implantaat van geïnfecteerde catheter stuks op de achterkant van Sprague Dawley 15. Dit model werd met succes gebruikt in ons laboratorium biofilm gevoeligheid testen fluconazol en echinocandine medicijnen 5,16, namelijk combinatoriële therapie van diclofenac en caspofungine 17 bestuderen. Recenter passen wij deze voor gebruik in BALB / c muizen 18,19. Invergelijking met andere in vivo modellen, het belangrijkste voordeel van deze subcutaan model is de mogelijkheid om meerdere biofilms per dier ontwikkeld binnen het lumen van geïmplanteerde katheter stukken te bestuderen.
Om het aantal proefdieren verminderen, hebben wij dit model aan de ontwikkeling van C. bestuderen aangepast albicans biofilms niet-invasief met behulp van bioluminescentie beeldvorming (BLI) 18,19. Deze werkwijze bleek een krachtige techniek die kan worden gebruikt om biofilms kwantificeren meten van de specifieke BLI signaal op het gebied van belang (in ons geval het gebied van geïmplanteerde katheters), het vermijden van dierlijk offer. In vergelijking met bacteriën die zowel het gen en het substraat vereist voor de bioluminescentie reactie kan uitdrukken door de invoering van een specifiek lux operon 20 meeste eukaryote organismen, zoals C. albicans, zijn afhankelijk van de heterologe expressie van een luciferase gen in combinatie met deexterne toediening van een specifiek substraat, zoals D- luciferine of coelenterazine 21. Waarschijnlijk door de aanwezigheid van de schimmel celwand en C. albicans morfogenese, de intracellulaire aflevering van het substraat voor het enzym luciferase was een grote uitdaging 21. Om dit probleem op te lossen, Enjalbert et al. 22 gemanipuleerde een stam waarin een synthetisch C. albicans-codon geoptimaliseerde versie van het gen voor de natuurlijk uitgescheiden Gaussia princeps luciferase (Gluc) werd gefuseerd met de C albicans PGA59 gen, een GPI verankerde celwand eiwit. Door de aanwezigheid van luciferase in de celwand, kunnen problemen met de intracellulaire beschikbaarheid van het substraat worden voorkomen. Dit bijzondere systeem werd gebruikt om oppervlakkige infecties veroorzaakt door C. bestuderen albicans 22. Zeer recent BLI werd ook gebruikt om de progressie van orofaryngeale candidiasis en mogel followe behandeling 23. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van BLI als een veelbelovende techniek infecties veroorzaakt door vrij levende cellen maar ook device geassocieerde infecties te bestuderen.
In deze studie beschrijven we de C. albicans biofilm ontwikkeling van polyurethaan katheter stukken in BALB / c muizen en kwantificering middels BLI. We geven een gedetailleerd protocol van in vitro kolonisatie van polyurethaan katheters gedurende de adhesie gevolgd door implantatie in muizen en verdere biofilm ontwikkeling in levende dieren. Naast het meten van het BLI-signaal uitgezonden door de C. albicans cellen, ook de kolonievormende eenheden vergelijking met de standaard techniek voor biofilm fungale belasting kwantificering bepalen.
De toepassing van diermodellen en vooral knaagdiermodellen, voor studies gewijd aan microbiële biofilms zeer belangrijk als gastheer immuunsysteem is een essentiële factor bij biofilmvorming die in vitro modellen kunnen niet verklaren. In deze studie beschrijven we een relatief eenvoudige subcutane C. albicans biofilm muismodel, die gemakkelijk in een onderzoekslaboratorium kan worden vastgesteld en geen sterke technische vaardigheden vereist. Dit model is aanvankelijk ontwikkeld Staphylococcus e…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
Agar granulated | Difco | 214530 | |
D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
Equipment | |||
Cell counting chamber | |||
Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
Electric razor | For small animals | ||
Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
Heating pad | Leica | 14042321474 | |
Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |