Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).
Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein’s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.
Protein interaksjon nett (PIN) har en lav oppløsning kart over hvordan proteiner er funksjonelt organisert i cellen 1. Hver fysisk forbindelse mellom to proteiner eller protein-protein interaksjoner (PPI), kan representere en forening som er stabil med tiden, slik som de som finnes i proteinkomplekser og som bidrar til den strukturelle organisering av cellen. Disse tilkoblingene kan også representere forbigående foreninger som regulerer aktiviteten, stabilitet, lokalisering og interaksjoner mellom de to partnerne. Identifisere de fysiske interaksjonspartnere til et gitt protein gir derfor rik informasjon om funksjon og regulering av at protein 2,3. For disse grunner har store anstrengelser blitt satt mot kartlegging av PIN-koder i modellorganismer, inkludert Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster </ Em> 13, elegans Caenorhabditis 14 og Homo sapiens 15. Disse studiene har gitt viktig innsikt i hvordan proteiner er organisert i cellen og dermed nøkkelinformasjon om proteiner med tidligere ukjente funksjoner.
Flere strategier har blitt utviklet gjennom årene for å studere PIN-koder. Disse teknologiene kan grovt deles inn i tre kategorier basert på hva slags informasjon de gir på PPIs (anmeldt i 16-18). Den første er basert på gjær to-hybrid og dets derivater 19. Disse teknologiene gir informasjon om den direkte sammenhengen mellom par av proteiner, som gjør det mulig å konstruere binære nettverk. Den andre familie er basert på affinitetsrensing av agn proteiner og identifisering av de tilknyttede partnere, som f.eks affinitetsrensing etterfulgt av massespektrometri 20. Disse tilnærmingene identifisere grupper av proteiner som er direkteeller indirekte forbundet, generelt på en stabil måte, og er meget kraftige til å identifisere proteinkomplekser. Den tredje tilnærmingen er basert på protein-fragment komplemente analyser (PCAs) 11,21. Denne tilnærmingen gir et middels nivå av oppløsning mellom de to tidligere tilnærminger, som gjør det mulig å påvise direkte og proksimale assosiasjoner mellom proteiner. Hver teknikk har sine egne styrker og svakheter, som nylig anmeldt 18.
Den best beskrevet eukaryote PIN er den desidert en av de spirende gjær Saccharomyces cerevisiae, delvis fordi dens proteom- er relativt mindre kompleks enn de andre modell eukaryoter og fordi high-throughput analyser for å påvise PPIs først har blitt analysert og er mer effektivt implementert i denne modellorganisme 9-12. En spesielt kraftig metode for gjær systemet er dihydrofolatreduktase protein-fragment komplemente assay (DHFR-PCA), en metode som har værtbrukes i ulike sammenhenger for å studere gjær PIN i standard og perturbed forhold 11,22-26. Denne metoden er avhengig av en overlevelse analyse som gjør det mulig å påvise direkte og nesten direkte PPIs for en gitt agn protein på både endogene uttrykk nivåer og innfødte subcellulære lokaliseringer av interaksjonspartnere 11,21 i en kvantitativ måte 27. Den oppnådde ved hjelp av denne analyse (dvs. kolonistørrelse på høy tetthet koloni arrays) signal reflekterer således mengden av proteinkomplekser dannet mellom agn og byttedyr i et cellulært miljø nesten ekvivalent med en av villtype-celler. Analysen er basert på omdanning av et reporter-enzym som er involvert i folatmetabolismen, dihydrofolat reduktase (DHFR), hvorved to komplementære fragmenter av DHFR som er smeltet sammen med de to proteiner av interesse bringes i nærhet når de to proteiner påvirker hverandre, der i sin tur fører til reversible rekonstituering av enzymaktiviteten 11 og vekst av stammen på et medium inneholdende methotrexat (MTX; figur 1). Denne forbindelse hemmer den endogene DHFR-enzymet, men ikke den muterte en benyttet i analysen 28. To samlinger av PCA stammer, en som inneholder ~ 4300 Mata-stammer med en ORF smeltet til DHFR F [1,2] fragment og en som inneholder ~ 4800 MAT α stammer med en ORF smeltet til DHFR [3] fragment, kan kjøpes til implementere DHFR-PCA på liten eller stor skala i ethvert laboratorium. Her beskriver vi en generell men detaljert protokoll til skjermen for PPIs mellom ett agn protein og ~ 4800 byttedyr proteiner ved hjelp av denne analysen.
Vi beskriver en protokoll basert på DHFR-PCA-analyse gjør det mulig systematisk identifisering av fysiske interactors for en gitt agn protein ved høy gjennomstrømning. Denne protokollen kan tilpasses ved screening for flere agn, og dette på en hvilken som helst ønsket nivå av replikasjon. Vi demonstrerer påliteligheten av denne protokollen ved identifisering av fysiske interaksjonspartnere for et agn protein involvert i Nuclear Pore Complex: Nup82. Vår analyse aktivert finne fem tidligere rapporterte interactors og en tidligere urapporterte Interactor (Tall 3F & 3G), fremhever muligheten av metoden for å studere gjær protein interactome.
Protokollen er beskrevet her inneholder flere kritiske trinn som eksperimentator bør ta hensyn. Vi anbefaler å 1) Kontroller at agn DHFR F [1,2] fusjon er riktig (figur 1B); Dette kan bli oppnådd ved sekvensering av konstruksjonen og Målting riktig protein ekspresjon ved hjelp av et anti-DHFR F [1,2] eller anti-DHFR-F [3] antistoff; 2) Før du begynner skjermen, anbefales det å kontrollere om noen agn av interesse viser promiskuøse interaksjoner i PCA-skjermer. Dette kan gjøres ved å utføre kontrollskjermer med agn krysset med den passende L-DHFR-kontroll, eller ved parring manuelt agnet med det passende L-DHFR kontroll og utfører en vekstanalyse i MTX medium. 3) Plater bør helles dagen før de brukes slik at fuktighet er optimal for celle tilslutning på agar overflaten under trykkeprosessen; 4) Kilde platene ikke bør brukes mer enn fire ganger for å overføre nok celler på destinasjonen plate. Økende antall kopier av destinasjonen plate kan gjøres ved suksessive trinn av ekspansjon (f.eks 4 eksemplarer -> 16 eksemplarer -> 64 eksemplarer). Alternativt kan cellene bli plukket i forskjellige posisjoner på plenene eller i kolonien mellom ulike runder med replikering; 5) Hvis flere positions mangler etter den diploide utvalg (s), sørg for at kilde platene ikke ble brukt for mange ganger i parings trinn (trinn 04.05 til 04.07); 6) Kontroller at MTX medium inneholder alle essensielle ingredienser på de riktige konsentrasjoner. Faktisk, hvis ingen vekst i det hele tatt er observert på MTX medium, kan det være enten fordi ingen interaksjon er detekterbar ved PCA for proteinene av interesse, eller på grunn av MTX-medium ble ikke fremstilt på riktig måte. For å sikre at det medium som tillater vekst av stammer som viser DHFR fragmenter komplementering, kan en konstitutiv interaksjon legges på tomme stillinger innsamling og anvendt som en positiv kontroll, for eksempel DHFR-fragmenter fusjonert til leucin-glidelås-deler 33 (figur 1C). Parallelle tester ved hjelp av linker-DHFR fragmenter eller glidelås-linker-DHFR fragmenter vil tillate å diskriminere mellom forholdene som gjør at alle celler til å vokse (lav MTX konsentrasjon eller agn protein som har en tendens til å lage falske positive interaksjoner, som descrIbed nedenfor) og forhold som hindrer vekst av alle stammer (MTX For høy konsentrasjon eller viktig ingrediens mangler i medium); 7) Gitt at PCA utføres ved suksessive runder av replikasjoner fra ett medium til et annet, kan kryss-forurensning mellom stammene mellom forskjellige plater oppstå hvis, for eksempel, er pinne-verktøy ikke steriliseres skikkelig mellom replikasjonsrunder og / eller den siste vann bad (dvs. våt stasjon) i steriliseringsprosessen er forurenset av kolonier av tidligere replikering runder. Flere posisjoner på arrays er tom og kan dermed brukes som kontrollposisjoner hvor ingen vekst bør overholdes for å oppdage kryss forurensing.
Bildeanalyse kan utføres ved hjelp av flere publiserte programvare (se kapittel 5 i protokollen) eller eventuelle egendefinerte skript. I denne studien, utfører egendefinert skript følgende trinn: 1) Skriptet trekker fra pikselverdiene i en tom plate til pixel verdier av hver plate for å correct for skjevheter belysning. 2) Skriptet konverterer hvert bakgrunn korrigert bilde til binær ved hjelp av en pikselverdien terskel på 10. 3) For hver 1536 posisjonene til hver plate, fastsatt overliggende et rektangel på kanten kolonier, kjører skriptet ImageJ "Analyze partikler … "-funksjonen i en sirkulær markering. Den sirkulære valg settes med en radius som tilsvarer intervallet mellom to stillinger minus 10 piksler. 4) Skriptet velger det nærmeste partikkel fra sentrum av utvalget og bekrefter det som en koloni hvis beliggenheten er ikke mer enn halvparten av intervallet mellom to kolonier unna sentrum av utvalget. 5) Skriptet måler pikselverdier for den valgte partikkel på bakgrunnskorrigerte bilde. 6) For ytterligere å rette opp eventuelle gjenværende skjevheter bakgrunn belysning, subtraherer skriptet middelverdien av alle piksler fra sirkulær utvalg som ikke var en del av en partikkel til pikselverdier i kolonien. Summen av disse korrigert pixel verdir, som er lagret i kolonnen "IntDenBackSub" av Tilsetnings tabell 1, blir brukt som et mål på kolonistørrelse.
Et kritisk trinn i analysen del er valget av betydningen terskel. Her har vi valgt en terskel basert på fordelingen av den negative L-DHFR-F [3] kontroller, men avhengig av formålet med skjermen, kan slik terskel være for strenge. Faktisk, L-DHFR F [3] kontroller er overuttrykt (TEF sterk promoter) slik at de komplementære fragmenter kan spontant utfyller hverandre, og disse er derfor ikke representativt for ekspresjon av de fleste proteiner. Dette understrekes av det faktum at fordelingen av den L-DHFR-F [3] kontroller er høyere enn gjennomsnittet av bakgrunnsvekst (figur 3D). Dermed noen interaksjoner med score under denne strenge terskel, men det er klart utenfor bakgrunnen vekstfordelingen kan betraktes som mulige treff som kan representere, for eksempel, forbigående eller svak interhandlinger. Disse kan videre studert og kryss-validert hvis, for eksempel, er de to proteiner ikke uttrykkes på et nivå som kan tillate den spontane komplementering av DHFR-fragmenter som de L-DHFR kontroller. Som et alternativ, kunne man sette en betydning terskel basert på andelen av overlapping med rapporterte fysiske interactors i databaser som BioGRID 35 for å maksimere andelen av sanne positiver i løpet av falske positiver. Men i motsetning til bruk av L-DHFR fordeling, dette alternativ kan ikke alltid være mulig dersom, for eksempel, er antall kjente fysikalske interactors ikke er tilstrekkelig høy. Videre, har valget av betydning terskel en innvirkning på andelen av falske positive og falske negative i den endelige datasett. Faktisk, i likhet med enhver annen PPI påvisningsmetode, kan falske positive resultat av uspesifikke interaksjoner av et protein med DHFR-fusjonsproteinet dersom det for eksempel er proteinet meget rikelig som nevnt tidligere. Detteer eksemplifisert ved det faktum at noen jakter systematisk samvirke med alle agn proteiner i PCA-skjermer, og dermed må fjernes fra analysen 11 (f.eks Tef2 og Ade17 og Tilsetnings tabell 2). For å omgå dette problemet, en styre PCA skjermen av de to samlingene mot det passende L-DHFR-kontroll (F [1,2] eller F [3]) for å identifisere agn og jakter oppviser spontan DHFR fragmenter komplementering kan utføres i de spesifikke betingelser på hvert skjermbilde. Videre kan utføre en Gene Ontologi anrikning analyse øker tilliten til dataene hvis funksjon av en gitt agn er kjente. På den annen side kan DHFR-PCA gi opphav til falske negativer av flere grunner: 1) Ikke alle proteiner kan være kondensert til DHFR-fragmenter som disse kan destabilisere proteiner eller endre sin lokalisering hvis, for eksempel, DHFR-fusjon til C-terminale ende griper inn i et lokaliseringssignal; 2) DHFR rekonstituering i noen cellulære avdelinger may ikke produsere folat hvis, for eksempel, er ikke tilgjengelig en viktig forløper for folat syntese; 3) C-termini behov for å være innenfor en avstand på 8 nm for DHFR complementation å skje 11. Således kan en velkjent interaksjonen ikke bli detektert hvis deres C-termini ikke er nær nok på plass. Dette er eksemplifisert her ved det faktum at en stor fraksjon av Nup82 fysiske interaksjoner rapportert i databaser, hvorav de fleste er indirekte, ble ikke påvist i vår analyse. Likeledes vil interaksjonene mellom membranproteiner som C-termini er i trans-forhold til membranen ikke føre til DHFR fragmenter komplementering og vil ikke bli detektert 11. Begrensninger 1) og 3) kan omgås relativt enkelt ved å fusjonere DHFR-fragmentet til N-termini til proteinet. Dette kan hindre å forstyrre en lokaliseringssignal i nærheten av C-termini og kan tillate å oppdage et samspill mellom membran proteiner som N og C-terminalen er i cis relativetil membranen.
Flere utfordringer gjenstår i studiet av PIN-koder (anmeldt i 2,3). Kartene av PIN-koder produsert så langt har i stor grad blitt beskrevet i en enkelt eksperimentell betingelse for hver art og dermed tilby et enkelt bilde av hvordan protein nettverk kan være organisert. Det er derfor behov for utforskning av andre eksperimentelle forhold for å se hvordan PIN-koder kan bli omorganisert som svar på endringer i miljøet, bestemte stimuli, på tvers av utvikling eller følgende mutasjoner. Disse utfordringene vil bli overvunnet ved utvikling av nye teknologier for avhør PPIs i sanntid, i levende celler og ved å tilpasse dagens teknikker, slik at de kan brukes av et større fellesskap av laboratorier. Som en kvantitativ teknikk som kan detektere endringer i mengden av DHFR komplemente komplekser 27, kan DHFR-PCA være tilpasset for å overvinne disse utfordringer og har blitt brukt til å studere hvordan PPIer påvirkes av et DNA-ødeleggende middel 22 </sup>, kjemiske midler 25, gendelesjoner 23,26 eller i andre gjær arter og deres hybrider 33. Utforske disse nye dimensjoner vil bli mer og mer viktig å avdekke dynamikken i PIN-koden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institute of Health Research (CIHR) Grants 191 597, 299 432 og 324 265, en naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada Discovery stipend og Human Frontier Science Program stipend til CRL. CRL er en CIHR New etterforsker. Guillaume Diss er støttet av en PROTEO fellesskap. Samuel Rochette er støttet av NSERC og FRQNT stipend.
Name of Material/Equipement | Company | Catalog Number | Comments/Description |
BioMatrix Robot, Bench-top Configuration | S&P Robotics Inc. | BM5-BC | |
96-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-96-10 | Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins |
384-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-384-10 | Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins |
1536-format Pin-tool | S&P Robotics Inc. | PH-1536-05 | Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins |
Automated imaging module | S&P Robotics Inc. | IMG-02 | |
Methotrexate | Bioshop Canada Inc. | MTX440 | CAUTION: toxic compound |
Hygromycin B | Bioshop Canada Inc. | HYG003 | |
Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5010000 | |
Yeast-Interactome Collection | Thermo Scientific | YSC5849 | |
Omni Tray w/lid sterile | Thermo Scientific | 242811 | |
Anti-DHFR F[1,2] antibody | Sigma-Aldrich | D1067 | |
Anti-DHFR F[3] antibody | Sigma-Aldrich | D0942 |