Embryoid निकायों के विभिन्न आकारों से प्रेरित स्टेम से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) पाने (आईपीएस) प्रकोष्ठों
Summary
इस रिपोर्ट का उद्देश्य embryoid निकायों के विभिन्न आकारों का उपयोग कर प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है।
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं बाह्य कारकों एक साथ वयस्क कोशिकाओं reprogramming द्वारा ली गई स्टेम सेल का एक प्रकार है। इसके विपरीत, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs), स्टेम सेल की एक अन्य प्रकार, ब्लास्टोसिस्ट 2-3 की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से उत्पन्न कर रहे हैं। उनके अलग मूल के बावजूद, आईपीएस कोशिकाओं और ESCs इन विट्रो में और किसी भी प्रकार की कोशिका 4-5 में अंतर करने के लिए अपनी क्षमता में दोहराने के लिए उनके असीमित क्षमता में तुलना कर रहे हैं। आईपीएस कोशिकाओं की इन विशेषताओं उन्हें व्यक्तिगत पुनर्योजी चिकित्सा में अनुप्रयोगों के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं। हाल के शोध प्रयासों के रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के 6-11 सहित विशेष वयस्क कोशिकाओं के निर्माण के लिए मजबूत भेदभाव प्रोटोकॉल के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।
आईपीएस ली गई कोशिकाओं के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए, कि विशेष सेल प्रकार के लिए एक निर्देशित भेदभाव आवश्यक है। विभिन्न तरीके हैंउनकी दक्षता 6-7, 12-16 में बहुत भिन्न होता है कि RPE में दोनों ESCs और आईपीएस कोशिकाओं का निर्देश दिया भेदभाव के लिए प्रकाशित किया। हम अभी भी विकास या भेदभाव के दौरान सेल / ऊतक भाग्य को नियंत्रित करने वाले आणविक घटनाओं के कई पता नहीं है। हाल के वर्षों में, के प्रयासों को जितना संभव हो उतना embryological विकास नकल कर सकते हैं कि भेदभाव प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए बनाया गया है। ब्लास्टोसिस्ट चरण के दौरान, स्टेम सेल के अवचनबद्ध जनसंख्या एक तीन आयामी microenvironment में एक साथ हैं। तो, विभिन्न रणनीतियों एक साथ इकट्ठे ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं को बनाने और तीन आयामों में उन्हें विकसित करने के लिए लागू किया गया। ये स्टेम सेल समुच्चय embryoid निकायों (ईबीएस) कहा जाता है। अध्ययनों से स्टेम कोशिकाओं के ईबी भेदभाव भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरण की नकल और अनायास अपने बाहरी सतह पर आदिम अन्तर्जनस्तर को जन्म दे सकते हैं कि पता चला है। ईबी विकास की प्रगति के रूप में बाद में, सभी तीन रोगाणु प्रजातियों की विभेदित सेल phenotypes 17-18 दिखाई देते हैं। गुerefore, ईबीएस आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव के लिए ध्यान की एक बहुत आकर्षित किया है और स्टेम सेल 13 से RPE पीढ़ी के लिए एक अच्छे उम्मीदवार हैं।
ईबीएस ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं से कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभ में, ईबीएस पक्षपाती कालोनियों बंद scraping और गैर-पक्षपाती निलंबन संस्कृति में उन्हें बनाए रखने के द्वारा किए गए थे। हालांकि, इस दृष्टिकोण कम reproducibility के कारण बनता है कि ईबीएस की विषम जनसंख्या पैदावार। फांसी ड्रॉप सेल संस्कृति और microwell आधारित ईबीएस गठन अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि परिभाषित आकार के समरूप ईबीएस उपज जो ईबीएस गठन के लिए अन्य लोकप्रिय तकनीक है। इसके अलावा, microwell तकनीक कम प्रयास के साथ समुच्चय के बड़ी संख्या में अर्जित कर सकते हैं।
ईबीएस के भीतर कोशिकाओं के भेदभाव बाह्य और intracellular microenvironment से morphogenic cues के एक मल्टीप्लेक्स के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। एक सोम में भेदभाव के विपरीतolayer प्रारूप, ईबीएस कोशिकाओं की जटिल विधानसभा और 17 के लिए होते हैं कहनेवाला संकेतन के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। दिलचस्प है, व्यक्तिगत ईबीएस बनाने के लिए इस्तेमाल स्टेम कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं के भाग्य को प्रभावित करने के लिए मनाया गया। 1000-सेल ईबी एर्य्थ्रोइद वंश 20 की ओर धकेल दिया है, जबकि उदाहरण के लिए, मानव ESCs के एक hematopoietic भेदभाव अध्ययन में यह 500-सेल ईबी माइलॉयड वंश के प्रति भेदभाव को बढ़ावा दिया है कि मनाया गया। एक अन्य अध्ययन में, छोटे ईबीएस न्यूरो बाहरी झिल्ली भेदभाव 11, 17 की दिशा में पदोन्नत बड़ा ईबीएस जबकि अन्तर्जनस्तर भेदभाव का समर्थन किया।
ये पिछले अध्ययनों दृढ़ता से व्यक्तिगत ईबीएस बनाने के लिए इस्तेमाल ईएससी / आईपीएस कोशिकाओं की संख्या किसी भी प्रकार की कोशिकाओं को भेदभाव आधारित ईबीएस को प्रभावित करने वाले सुझाव देते हैं। हालांकि, हमारे ज्ञान करने के लिए, RPE की दिशा में अंतर करने के लिए अपनी प्रवृत्ति में ईबीएस आकार के प्रभाव को स्पष्ट कर दिया है कि कोई मौजूदा अध्ययन कर रहे हैं। इस अध्ययन के लक्ष्य के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए हैरेटिना वर्णक उपकला (आईपीएस) RPE भेदभाव और RPE वंश की ओर निर्देशित भेदभाव के लिए ईबीएस बनाने के लिए इष्टतम सेल नंबर की पहचान के लिए – प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं पर ईबी आकार।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल थेरेपी के लिए स्टेम सेल का पूरा वादा एहसास करने के लिए, यह एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में उनके भेदभाव को विनियमित करने के लिए आवश्यक है। इस रिपोर्ट microwell थाली प्रौद्योगिकी का उ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
