Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler
Summary
Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri dış faktörlerin 1 yetişkin hücrelerinin yeniden programlanması türetilen pluripotent kök hücrenin bir türüdür. Bunun aksine, embriyonik kök hücrelerin (EKH), pluripotent kök hücrenin başka bir tip blastosist 2-3 iç hücre kitlesi elde edilmiştir. Farklı kökenlerden rağmen, iPS hücreleri ve EKH in vitro ve herhangi bir hücre tipine 4-5 içine ayırt etme kapasitesinde çoğaltmak için onların sınırsız kapasite karşılaştırılabilir. IPS hücrelerinin bu özellikleri onları kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp uygulamaları için ideal bir aday olun. Son araştırma çabaları retina pigment epiteli (RPE), 6-11 dahil olmak üzere özel yetişkin hücreleri üretmek için sağlam farklılaşma protokolleri geliştirmeye odaklandık.
IPS türetilen hücrelerin potansiyel klinik uygulamaları için, belirli bir hücre tipi için yönlendirilmiş bir farklılaşma gereklidir. Çeşitli yöntemler vardıronların verimlilik 6-7, 12-16 büyük ölçüde değişir RPE içine hem EKH ve iPS hücrelerinin yönettiği farklılaşması için yayınladı. Biz hala geliştirme veya farklılaşması sırasında hücre / doku kaderi yöneten moleküler olayların pek bilmiyorum. Son yıllarda, çabalar mümkün olduğunca embriyonik gelişimini taklit edebilir farklılaşma protokol geliştirmek için girişimlerde bulunulmuştur. Blastosist aşamasında, kök hücrelerin kaydedilmemiş nüfusu üç boyutlu mikroçevresinin birlikte bulunmaktadır. Yani, çeşitli stratejiler araya ESC / iPS hücrelerini yapmak ve üç boyutlu onları büyümeye uygulanmıştır. Bu kök hücre agrega embriyoid organları (EBS) denir. Çalışmalar kök hücrelerin EB farklılaşma embriyo gelişiminin erken evre taklit ve kendiliğinden onun dış yüzeyinde ilkel endoderm neden olduğunu göstermiştir. EB gelişme ilerledikçe sonra, her üç germ soylarının farklılaştırılmış hücre fenotipleri 17-18 görünür. Therefore, EBS tabanlı farklılaşma protokolleri ESC / iPS hücrelerinin in vitro farklılaşması için dikkat çekti ve pluripotent kök hücrelerinden 13 den RPE nesil için iyi bir aday olduğunu var.
EBS ESC / iPS hücrelerinden çeşitli yöntemlerle yapılabilir. Başlangıçta, EBS yapışkan koloniler kazıma ve yapışmayan süspansiyon kültürü içinde muhafaza edilerek yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım, düşük tekrarlanabilirlik neden EBS heterojen nüfus verir. Asma damla hücre kültürü ve mikro temelli EBS formasyonu oldukça tekrarlanabilir tanımlanan boyutlarda homojen EBS verim EBS oluşumu için diğer popüler teknikler vardır. Ayrıca, mikro tekniği daha az çaba ile agreganın çok sayıda elde edebilirsiniz.
EBS içindeki hücrelerin farklılaşması dışı ve hücre içi mikroçevreden morfojenik ipuçları bir multiplex tarafından düzenlenir. Bir mon farklılaşma aksineolayer biçimi, EBS hücrelerin karmaşık montaj ve 17 oluşmasına arası sinyalizasyon için bir platform sağlar. İlginç bir şekilde, tek tek EBS yapmak için kullanılan pluripotent kök hücre sayısı hücrelerin kaderini etkileyen gözlenmiştir. 1000 hücre EB eritroid soy 20 doğru itilir ise, örneğin, insan EKH bir hematopoietik farklılaşma çalışmada 500 hücre EB myeloid doğru farklılaşmasını teşvik ettiği görülmüştür. Bir başka çalışmada, küçük EBS nöro-ektoderm farklılaşma 11, 17 doğru terfi büyük EBS ise endoderm farklılaşma tercih.
Bu geçmiş çalışmalar kuvvetle bireysel EBS yapmak için kullanılan ESC / iPS hücrelerinin sayısı herhangi bir hücre tiplerine farklılaşma esaslı EBS etkilediğini göstermektedir. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, RPE doğru ayırt etmek eğiliminde EBS büyüklüğü etkisini aydınlatılamamıştır var hiçbir geçerli çalışmalar vardır. Bu çalışmanın amacı etkisini karakterize etmekRetina pigment epiteli (RPE iPS-) farklılaşma ve RPE soy yönelik farklılaşması için EBS yapmak için en uygun hücre sayısını belirlemek için – uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri üzerine EB boyutu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre tedavisi için pluripotent kök hücrelerin tam söz gerçekleştirilmesi için, tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kendi farklılaşma atılması için gereklidir. Bu rapor, mikro plaka teknolojisini kullanarak boyutu kontrollü EBS oluşturan RPE doğru farklılaşma başlatmak ve RPE protein ve gen göstergeleri tanımlamak için protokolleri açıklar. In vitro olarak farklılaşma senkronize etmek için, EBS homojen boyutları zorunlu agregasyonu mikro plakalara santrifüj iPS hücrelerinin bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
