सच का पता लगाने के लिए माउस बी वंश प्रकोष्ठों आईजीई व्यक्त
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
बी लिम्फोसाइट इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (IGH) वर्ग स्विच पुनर्संयोजन (सीएसआर) शुरू में आईजीएम ऐसे आईजी ऐ, आईजीई और आईजीजी के रूप में अन्य IGH आइसोटाइप, स्विच करने के लिए व्यक्त की जिसमें एक प्रक्रिया है। इन विट्रो में IGH सीएसआर के मापन आणविक और सेलुलर इम्यूनोलॉजी के पहलुओं को डीएनए पुनर्संयोजन और मरम्मत से लेकर जीवविज्ञान प्रक्रियाओं के एक नंबर के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। इन विट्रो सीएसआर परख सक्रिय बी कोशिकाओं पर प्रवाह cytometric माप सतह पुलिस महानिरीक्षक अभिव्यक्ति शामिल है। आईजी ऐ और आईजीजी उपवर्गों की माप सीधा है, वहीं इस विधि द्वारा आईजीई का माप की वजह से घुलनशील आईजीई FcεRII के लिए बाध्य करने के लिए समस्याग्रस्त है / CD23 सक्रिय बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की है। यहाँ हम संस्कृति में सीएसआर आया है कि माउस बी कोशिकाओं आईजीई-उत्पादन की सही माप के लिए एक अद्वितीय प्रक्रिया का वर्णन। विधि cy द्वारा बी वंश कोशिकाओं आईजीई उत्पादक का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, सेल सतहों पर आईजीई-CD23 परिसरों की ट्रिप्सिन की मध्यस्थता दरार पर आधारित हैtoplasmic धुंधला। यह प्रक्रिया आईजीई के लिए सीएसआर के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक समाधान प्रदान करता है।
Introduction
चूहों और इंसानों में इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (IGH) वर्ग स्विच पुनर्संयोजन (सीएसआर) के दौरान, IGH, लगातार क्षेत्र एक्सॉनों (Cμ) नष्ट कर दिया और नीचे की ओर निरंतर क्षेत्र एक्सॉनों के कई सेट में से एक (सी एच एस) (जैसे Cγ द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं μ अन्य पुलिस महानिरीक्षक वर्गों (जैसे आईजीजी, आईजीई, या आईजी ऐ) के उत्पादन के लिए आईजीएम के उत्पादन से एक स्विच में जिसके परिणामस्वरूप Cε, और Cα),। सीएसआर सी एच एस 1 के प्रत्येक सेट करने के लिए '5 स्थित 10/01 केबी दृश्यों रहे हैं, जो स्विच (एस) क्षेत्रों के भीतर होता है। सक्रियण प्रेरित Cytidine deaminase (सहायता) एंजाइम cytidine deamination गतिविधि के माध्यम से सीएसआर शुरू की।
आईजीई एलर्जी रोग दो की एक प्रमुख मध्यस्थ और आईजीई का उत्पादन किया और atopic रोग के लिए नए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए दरवाजे खोल सकता है नियंत्रित किया जाता है कैसे का एक बड़ा समझ है। चूहों और इंसानों में, आईजीई सबसे कसकर विनियमित पुलिस महानिरीक्षक निर्धारण है। आईजीई सामान्य रूप से टिम के स्तर हजारों में पता चला हैतों अन्य IGH से कम तीन आइसोटाइप, लेकिन अत्यधिक रोग राज्यों चार में ऊपर उठाया जा सकता है। हालांकि, आईजीई के लिए सीएसआर अधूरे समझा जाता है। बी कोशिकाओं की इन विट्रो सक्रियण आईएल -4 विरोधी CD40 या LPS या तो साथ संयोजन में, दोनों IgG1 और आईजीई से 5 सीएसआर लाती इस्तेमाल करते हैं। सक्रिय बी कोशिकाओं घुलनशील आईजीई सीएसआर के बाद संस्कृति में स्रावित बांधता है जो कम आत्मीयता आईजीई रिसेप्टर FcεRII / CD23 2,6, व्यक्त करते हैं। प्रवाह cytometry के साथ विश्लेषण इसलिए, जब रिसेप्टर बाध्य आईजीई दाग के साथ बी कोशिकाओं इसी तरह endogenously आईजीई 7 व्यक्त कोशिकाओं बी। यह है कि माउस बी में जाना जाता है जबकि कोशिकाओं यह IgG1 के लिए कक्षा स्विचिंग की माप के साथ हस्तक्षेप करने के लिए प्रकट नहीं होता है कि हमारे अनुभव में कम आत्मीयता आईजीजी रिसेप्टर FcγRIIB1 (CD32) 8, व्यक्त करते हैं। संस्कृति में बी सेल सक्रियण के बाद आईजीई स्विचिंग मापने हालांकि, जब अविशिष्ट सतह बाध्य आईजीई विश्लेषण अस्पष्ट हो सकता है। आम धुंधला तरीकों के साथ, गैर आईजीई व्यक्त कोशिकाओं आईजीई के लिए सकारात्मक दाग।
यहाँ रेखांकित चूहों 9 से सच आईजीई व्यक्त बी कोशिकाओं सीएसआर assays के आचरण और पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है कि एक रणनीति है – 11। Trypsin के साथ सक्रिय बी कोशिकाओं के उपचार, एक आम प्रयोगशाला अभिकर्मक प्रोटीन को पचाने के लिए, cytophylic और झिल्ली दोनों बाध्य सतह आईजीई हटा। साइटोप्लास्मिक आईजीई के लिए बाद permeabilization और धुंधला इस प्रकार सच्चे आईजीई उत्पादक कोशिकाओं का पता चलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विरोधी CD40 और आईएल -4 के साथ संस्कृति में माउस प्लीहा बी कोशिकाओं की उत्तेजना IgG1 और आईजीई से 5 टी सहायक टाइप 2 (टी एच 2) बातचीत, उत्साहवर्धक वर्ग स्विचिंग अनुकरण करेंगे। बी कोशिकाओं कुल splenocytes 12 या के …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW एनआईएच अनुदान AI089972 और AI113217, द्वारा और mucosal इम्यूनोलॉजी अध्ययन दल द्वारा समर्थित है, और बरोज़ वेलकम कोष से चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए एक कैरियर पुरस्कार रखती है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
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