Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells

Summary

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Abstract

B-Lymphozyten-Immunglobulin schwere Kette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) ist ein Verfahren, bei dem zunächst ausgedrückt IgM schaltet auf andere IgH Isotypen, wie IgA, IgE und IgG. Messung der IgH CSR in vitro ist ein Schlüsselverfahren für die Untersuchung einer Reihe von biologischen Prozessen, die von DNA-Rekombination und Reparatur, um Aspekte der molekularen und zellulären Immunologie. In vitro CSR Assay das durchflusszytometrische Meßfläche Ig-Expression auf aktivierten B-Zellen. Während Messung des IgA- und IgG-Subklassen ist einfach, ist die Messung von IgE durch dieses Verfahren problematisch aufgrund löslichen IgE-Bindung an FcεRII / CD23, das auf der Oberfläche von aktivierten B-Zellen. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Verfahren für die genaue Messung von IgE-produzierende Maus-B-Zellen, die CSR in Kultur erfahren haben. Das Verfahren basiert auf Trypsin-vermittelten Spaltung von IgE-CD23-Komplexen auf der Zelloberfläche gehalten und erlaubt die Detektion von IgE-produzierenden B-Linie Zellen durch cytoplasmic Färbung. Dieses Verfahren bietet eine komfortable Lösung für die durchflusszytometrische Analyse von CSR an IgE.

Introduction

Während der schweren Immunglobulinkette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) in Mäusen und Menschen, μ die IgH Exons der konstanten Region (C & mgr;) gelöscht und durch eine von mehreren Sätzen von nachgeschalteten Exons der konstanten Region (C _H s) (z Cy ersetzt, C & egr; und C & alpha;), was zu einem Wechsel von der Herstellung von IgM auf die Herstellung von anderen Ig-Klassen (beispielsweise IgG, IgE oder IgA). CSR tritt innerhalb Schalter (S) Regionen, die 1-10 kb-Sequenzen, die 5 'an jeden Satz von C _H s ¹ sind. Die Aktivierungs-induzierte Cytidindeaminase (AID) Enzym initiiert CSR über Cytidin Desaminierung Aktivität.

IgE ist ein wichtiger Mediator der allergischen Erkrankung ² und ein besseres Verständnis dafür, wie IgE produziert und reguliert kann Türen zu neuen Therapieansätzen zu atopischen Erkrankung zu öffnen. In Mäusen und Menschen, ist die IgE streng reguliert Ig Isotyp. IgE wird normalerweise in Mengen Tausende von tim erkanntes weniger als andere IgH Isotypen ^3, kann jedoch stark bei Krankheitszuständen ⁴ erhöht werden. Jedoch CSR an IgE ist nicht vollständig verstanden. In vitro-Aktivierung von B-Zellen mit IL-4 in Kombination mit entweder Anti-CD40 oder LPS induziert CSR sowohl IgG1 und IgE ^5. Aktivierte B-Zellen exprimieren den niedrigen affinen IgE-Rezeptors FcεRII / CD23 ^2,6, die die lösliche IgE in Kultur nach CSR abgesondert bindet. Deshalb bei der Analyse mit Durchflusszytometrie, B-Zellen mit rezeptorgebundenen IgE-Färbung ähnlich wie Zellen endogen exprimierenden IgE ^7b. Obwohl bekannt ist, dass die Maus-B-Zellen das geringe Affinität IgG-Rezeptor FcγRIIB1 (CD32) ^8, in unserer Erfahrung ist es offenbar nicht mit der Messung der Klassenwechsel zu IgG1 stören. Allerdings, wenn die Messung IgE Schalt nach B-Zell-Aktivierung in der Kultur, nicht spezifische oberflächengebundene IgE kann die Analyse verschleiern. Mit gemeinsamen Färbeverfahren, Fleck nicht IgE-exprimierenden Zellen positiv für IgE.

Hier skizziert ist eine Strategie, die verwendet worden ist, um CSR-Tests von Mäusen ⁹ durchführen und erkennen wahre IgE-exprimierenden Zellen, B ^{– 11.} Behandlung von aktivierten B-Zellen mit Trypsin, einem gemeinsamen Labor-Reagens, um Protein zu verdauen, entfernt sowohl cytophylic und Membran-gebundenen Oberfläche IgE. Nachfolgende Permeabilisierung und Färbung für zytoplasmatische IgE zeigt somit die wahren IgE-produzierenden Zellen.

Protocol

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien und von Tierforschung Kinderkrankenhaus (ARCH), Boston, Mass zugelassen. 1. Vorbereitung der Reagenzien 1,000x IL-4 Stock: Verdünnen IL-4 Cytokins an 20 ug / ml in H 2 O oder 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Dispense in 200 ul Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. 1,000x anti-CD40: Beziehen des Herstellers bei…

Representative Results

Dieses Verfahren wurde erfolgreich durchgeführt, um CSR an IgE in Maus-B-Zellen zu untersuchen. Um die Effizienz bei der Messung CSR demonstrieren angeregt wir Maus Milz-B-Zellen mit anti-CD40 und IL-4, wie zuvor beschrieben 11. Nach fünf Tagen der Stimulation wurden die Zellen gesammelt und mit dem vorstehend beschriebenen und mit fluoreszierend markierten IgM, IgG1, IgE und B220 (CD45R) Antikörpern gefärbt Protokoll verarbeitet. An Strahl Lymphozyten (1), eine klare Population von IgE +…

Discussion

Stimulation von Maus-Milz-B-Zellen in Kultur mit Anti-CD40 und IL-4 wird T-Helfer Typ 2 _(TH 2) Wechselwirkungen, ermutigend Klassenumschaltzeit IgG1 und IgE ⁵ simulieren. B-Zellen können für CSR im Rahmen der Gesamt Splenozyten ¹² oder als gereinigte Milz-B-Zellen, ¹¹ aktiviert werden. Wie in dem Protokoll (Schritt 2.3) angemerkt, ist B-Zell-Anreicherung optional, und liegt im Ermessen des Experimentators, ob es von Vorteil, zu ermitteln. Positive magnetische Trennung von B-…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Mouse IgE FITC	BD Pharmingen	553415	clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	clone A85-1
Methanol	BDH	BDH1135-4LP	Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40	eBioscience	16-0402-85	clone HM40-3
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100X)	Gibco	11140-050
Phosphate Buffered Saline (10X)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS purification column	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10X)	Sigma Aldrich	T4174-100mL	5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100mL	10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)
L-Glutamine 200mM	Sigma Aldrich	G7513
2-mercaptoethanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100mL
Red cell lysis buffer	Sigma Aldrich	R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7	SouthernBiotech	1140-17	clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum	Thermo	SH30910.03
B cell Stimulation media			B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,  1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL)