Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B linfociti immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) è un processo in cui inizialmente espresso IgM passa ad altri isotipi IgH, come IgA, IgE e IgG. Misurazione di IgH CSR in vitro è un metodo fondamentale per lo studio di un certo numero di processi biologici che vanno dalla ricombinazione e riparazione del DNA agli aspetti della immunologia molecolare e cellulare. Test in vitro CSR coinvolge citofluorimetrica superficie di misurazione espressione Ig sulle cellule B attivate. Mentre la misurazione di IgA e IgG sottoclassi è semplice, misurazione delle IgE con questo metodo è problematico a causa IgE solubile legame FcεRII / CD23 espresso sulla superficie delle cellule B attivate. Qui si descrive una procedura unica per la misurazione accurata delle IgE-produzione di cellule del mouse B che hanno subito la RSI nella cultura. Il metodo si basa sulla tripsina-mediata scissione di complessi IgE-CD23 sulla superficie delle cellule, consente il rilevamento di IgE-cellule produttrici B lineage da cycolorazione toplasmic. Questa procedura offre una soluzione conveniente per l'analisi di citometria di flusso della RSI a IgE.
Introduction
Durante immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) in topi e nell'uomo, il IgH μ esoni regione costanti (Cu) vengono cancellati e sostituiti da uno dei diversi gruppi di downstream esoni regione costanti (C H s) (es Cγ, Cε e Cα), risultando in un interruttore dalla produzione di IgM alla produzione di altre classi di Ig (ad esempio IgG, IgE, o IgA). CSR avviene entro interruttore (S) le regioni, che sono 1-10 sequenze kb situati 5 'per ogni set di C H 1 s. L'attivazione indotta citidina deaminasi (AID) enzima avvia CSR attraverso l'attività citidina deamination.
IgE è un mediatore chiave della malattia allergica 2 e una maggiore comprensione di come IgE è prodotto e regolato può aprire le porte a nuovi approcci terapeutici per la malattia atopica. In topi e nell'uomo, IgE è isotipo Ig più strettamente regolata. IgE è normalmente rilevato livelli migliaia di times meno di altri IgH isotipi 3, ma possono essere molto elevati negli stati di malattia 4. Tuttavia, la RSI per IgE non è completamente comprensibile. In vitro attivazione delle cellule B con IL-4 in combinazione con anti-CD40 o LPS, induce la RSI sia IgG1 e IgE 5. Cellule B attivate esprimono il recettore a bassa affinità IgE FcεRII / CD23 2,6, che lega IgE solubile secreta nella cultura dopo CSR. Perciò quando si analizzano con citometria a flusso, le cellule B con il recettore legato IgE macchia simile a B cellule che esprimono endogenamente IgE 7. Mentre è noto che il mouse B cellule esprimono il recettore a bassa affinità IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, nella nostra esperienza non sembra interferire con la misura di commutazione classe IgG1. Tuttavia, quando si misura IgE commutazione dopo l'attivazione delle cellule B nella cultura, non specifica di superficie legato IgE può oscurare l'analisi. Con i metodi di colorazione comuni, le cellule non-IgE-esprimono macchia positivo per IgE.
Delineato qui è una strategia che è stata utilizzata per condurre test di CSR e rilevare vere cellule-IgE esprimono B da topi 9-11. Il trattamento delle cellule B attivate con tripsina, un reagente di laboratorio comune a digerire le proteine, rimuove sia cytophylic e la membrana superficiale legata IgE. Permeabilizzazione successiva e colorazione per citoplasmatica IgE rivela così le vere cellule-IgE che producono.
Protocol
Representative Results
Discussion
La stimolazione di topo milza cellule B in coltura con anti-CD40 e IL-4 simulerà T helper di tipo 2 (T H 2) le interazioni, il passaggio di classe incoraggiante IgG1 e IgE 5. Cellule B possono essere attivate per la RSI nel contesto di splenociti totale 12 o come purificati cellule B della milza 11. Come indicato nel protocollo (passo 2.3), B arricchimento delle cellule è opzionale, ed è a discrezione dello sperimentatore per determinare se sarebbe vantaggioso. Positivo sep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW è sostenuto da sovvenzioni NIH AI089972 e AI113217, e dalla mucosa Immunologia Studi della squadra, e in possesso di un Premio alla Carriera per medici scienziati del Wellcome Fondo Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
References
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