Påvisning av True IgE-uttrykke Mouse B Lineage Cells
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B-lymfocytt-immunoglobulin-tung kjede (avIgH) klasse bryter rekombinasjon (CSR) er en fremgangsmåte hvor utgangspunktet uttrykt IgM bytter til andre igh isotyper, så som IgA, IgE og IgG. Måling av in vitro avIgH CSR er en viktig metode for studiet av en rekke biologiske prosesser som strekker seg fra DNA-rekombinasjon og reparasjon for aspekter av molekylær og cellulær immunologi. In vitro CSR-analysen involverer strømningscytometrisk måling overflate Ig-ekspresjon på aktiverte B-celler. Selv om måling av IgA og IgG subklasser er enkel, er måling av IgE ved denne metode problematisk på grunn av oppløselig IgE-binding til FcεRII / CD23 uttrykkes på overflaten av aktiverte B-celler. Her beskriver vi en unik fremgangsmåte for nøyaktig måling av IgE-produserende mus-B-celler som har gjennomgått CSR i kultur. Metoden er basert på trypsin-formidlet kløyving av IgE-CD23 komplekser på celleoverflater, noe som åpner for deteksjon av IgE-produserende B-celler ved avstamning cytoplasmic farging. Denne prosedyren gir en praktisk løsning for flowcytometrisk analyse av CSR til IgE.
Introduction
Under immunoglobulin tung kjede (avIgH) klasse bryter rekombinasjon (CSR) i mus og mennesker, μ Igh konstant område eksoner (Cμ) slettes og erstattes med en av flere sett med nedstrøms konstant område eksoner (C H r) (f.eks Cγ, Cε, og Cα), noe som resulterer i en bryter fra produksjonen av IgM til produksjon av andre Ig-klasser (for eksempel IgG, IgE, IgA eller). CSR skjer innen switch (S) regioner, som er 1-10 kb sekvenser lokalisert 5 'til hvert sett med C H s 1. Aktiverings-Induced cytidindeaminase (AID) enzym initierer CSR via cytidine deaminering aktivitet.
IgE er en viktig formidler av allergisk sykdom 세스 og en større forståelse av hvordan IgE produseres og regulert kan åpne dører til nye terapeutiske tilnærminger til atopisk sykdom. Hos mus og mennesker, er IgE den mest strengt regulert Ig isotypen. IgE er normalt oppdages på nivåer tusenvis av times mindre enn andre avIgH isotyper tre, men kan være sterkt forhøyet i sykdomstilstander 4. Imidlertid er CSR til IgE ufullstendig forstått. In vitro-aktivering av B-celler ved hjelp av IL-4 i kombinasjon med enten anti-CD40 eller LPS induserer CSR til både lgG1 og IgE 5. Aktiverte B-celler uttrykker den lave affinitet IgE reseptor FcεRII / CD23 2,6, som binder løselig IgE utskilles i kultur etter CSR. Derfor når analysere med flowcytometri, B-celler med reseptor-bundet IgE flekken på samme måte som B-celler endogent uttrykker IgE 7. Mens det er kjent at mus B celler uttrykker den lave affinitet IgG reseptor FcγRIIB1 (CD32) 8, i vår erfaring det ser ikke ut til å forstyrre måling av klassen bytte til IgG1. Imidlertid, når man måler IgE veksling etter at B-celleaktivering i kultur, kan ikke-spesifikk overflate-bundet IgE tilsløre analysen. Med vanlige fargemetoder, ikke-IgE-uttrykker celler flekken positivt for IgE.
Skissert her er en strategi som har vært benyttet til å gjennomføre samfunnsansvar analyser og oppdage ekte IgE-uttrykke B-celler fra mus 9-11. Behandling av aktiverte B-celler med trypsin, til en felles lab reagens fordøye protein, fjerner både cytophylic og membranbundet overflate IgE. Påfølgende permeabilization og farging for cytoplasmic IgE avslører dermed den sanne IgE-produserende celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stimulering av mus splenic B-celler i kultur med anti-CD40 og IL-4 vil simulere T helper type 2 (T H 2) interaksjoner, oppmuntrende klasse veksling til IgG1 og IgE 5. B-celler kan aktiveres for CSR i sammenheng med totale splenocytes 12 eller som rene milt B-celler 11. Som nevnt i protokollen (trinn 2.3), er B-celle berikelse valgfritt, og er på skjønn av eksperimentator å fastslå om det ville gunstig. Positive magnetisk separasjon av B-celler ved hjelp av CD45R (B220) -me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW støttes av NIH tilskudd AI089972 og AI113217, og ved Mucosal Immunologi Studier Team, og har en karriere Award for Medisinsk Forskere fra Burroughs Wellcome Fondet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
