Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Summary

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Abstract

B imunoglobulina linfócitos cadeia pesada (HGI) recombinação mudança de classe (CSR) é um processo em que, inicialmente, expressa IgM muda para outros isotipos CMI, tais como IgA, IgE e IgG. Medição de IgH RSE in vitro é um método fundamental para o estudo de uma série de processos biológicos variam de recombinação e reparação do ADN de aspectos da imunologia molecular e celular. Ensaio in vitro RSE envolve a superfície de medição de citometria de fluxo a expressão de Ig em células B activadas. Embora a medição de IgA e IgG subclasses é simples, medição de IgE por este método é problemático devido à ligação de IgE a FceRII solúvel / CD23 expresso na superfície de células B activadas. Aqui, descrevemos um processo único para a medição precisa de IgE células B de ratinho produtora que tenham sido submetidos a RSE em cultura. O método baseia-se na clivagem mediada por tripsina de complexos IgE-CD23 na superfície das células, permitindo a detecção de células produtoras de IgE da linhagem B por cycoloração toplasmic. Este procedimento oferece uma solução conveniente para a análise de citometria de fluxo de CSR para IgE.

Introduction

Durante cadeia pesada de imunoglobulina (IgH) recombinação mudança de classe (CSR) em ratos e seres humanos, o IgH μ exons região constante (Cμ) são eliminados e substituídos por um dos vários conjuntos de jusante exons região constante (C _H s) (por exemplo, Cy, Cε, e Ca), resultando numa passagem da produção de IgM para a produção de outras classes de Ig (por exemplo, IgG, IgE, ou IgA). RSE ocorre dentro de regiões de troca (S), que são sequências de 1-10 kb localizado 5 'em cada conjunto de C _H ¹ s. A enzima Activação Induzida citidina-desaminase (AID) inicia RSE através da actividade de citidina de desaminação.

IgE é um mediador chave da doença alérgica ² e uma maior compreensão de como IgE é produzida e regulamentada pode abrir as portas para novas abordagens terapêuticas para a doença atópica. Em ratos e seres humanos, IgE é o isotipo Ig mais rigidamente controlado. IgE é normalmente detectada em níveis milhares de times menos do que outros isotipos de IgH ^3, mas pode ser muito elevado em estados de doença ^4. No entanto, a RSE para IgE é completamente compreendida. In vitro a activação de células B com IL-4 em combinação com anti-CD40 ou LPS, induz RSE para ambos IgG1 e IgE ^5. Células B ativadas expressar a baixa afinidade receptor IgE FceRII / CD23 ^2,6, que liga IgE solúvel secretada em cultura após CSR. Portanto, quando a análise por citometria de fluxo, as células B com receptor de IgE ligado a mancha de modo semelhante às células B expressando IgE ⁷ endogenamente. Embora se saiba que o mouse B células expressam a baixa afinidade IgG receptor FcγRIIB1 (CD32) ^8, em nossa experiência, não parece interferir com a medição da classe de comutação para IgG1. No entanto, quando se mede a IgE de comutação após a activação das células B em cultura, não específica ligada à superfície IgE pode obscurecer a análise. Com métodos de coloração comuns, as células não-IgE-expressando manchar positivamente para IgE.

Esboçado aqui é uma estratégia que tem sido utilizada para realizar ensaios de RSE e detectar células B expressando IgE verdadeiros de ratos ^9-11. O tratamento de células B activadas com tripsina, um reagente de laboratório comum para digerir a proteína, remove tanto cytophylic superfície e ligada à membrana de IgE. Permeabilização e subsequente coloração citoplasmática para IgE revela, assim, as células produtoras de IgE verdadeiros.

Protocol

NOTA: Todas as experiências descritas aqui foram de acordo com as diretrizes Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e aprovado pelo Animal Hospital Research para a Infância (ARCH), Boston, Massachusetts. 1. Preparação dos Reagentes 1.000x IL-4 Stock: Diluir citocina IL-4 a 20 ng / ml em H2O ou 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Distribuir em alíquotas de 200 ul a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar a -20 ° C. 1.000 vezes anti-CD40: obter do f…

Representative Results

Este procedimento foi implementado com sucesso para estudar CSR para IgE em células B de ratinho. Para demonstrar a eficiência na medição RSE, que estimulou as células B do baço de ratinho com anticorpo anti-CD40 e IL-4 como descrito anteriormente 11. Depois de cinco dias de estimulação, as células foram recolhidas e processadas utilizando o protocolo descrito acima e coradas com fluorescência marcado IgM, IgG1, IgE, anticorpos e B220 (CD45R). Recolhidas em linfócitos de detonação (Figura…

Discussion

A estimulação de células B do baço de rato em cultura com anti-CD40 e IL-4 irá simular tipo T helper 2 (T _H 2) interacções, troca de classe encorajador IgG1 e IgE ^5. As células B podem ser ativados para a RSE no âmbito do total esplenocitos ¹² ou células B do baço como purificados ^11. Como foi observado no protocolo (passo 2.3), o enriquecimento de células B é opcional, e fica ao critério do experimentador para determinar se seria benéfico. Separação magnétic…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Mouse IgE FITC	BD Pharmingen	553415	clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	clone A85-1
Methanol	BDH	BDH1135-4LP	Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40	eBioscience	16-0402-85	clone HM40-3
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100X)	Gibco	11140-050
Phosphate Buffered Saline (10X)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS purification column	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10X)	Sigma Aldrich	T4174-100mL	5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781-100mL	10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)
L-Glutamine 200mM	Sigma Aldrich	G7513
2-mercaptoethanol (99%)	Sigma Aldrich	M6250-100mL
Red cell lysis buffer	Sigma Aldrich	R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7	SouthernBiotech	1140-17	clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum	Thermo	SH30910.03
B cell Stimulation media			B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,  1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL)