Summary

Обнаружение Истинного IgE-выражения мышь B Lineage клеток

Published: December 01, 2014
doi:

Summary

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Abstract

B-лимфоцит тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) является процесс, в котором изначально выразил IgM переключается на другие IgH изотипами, таких как IgA, IgE и IgG. Измерение IgH КСО в пробирке является основным методом для изучения ряда биологических процессов, начиная от рекомбинации ДНК и ремонт, чтобы аспектах молекулярной и клеточной иммунологии. В пробирке КСО анализ включает измерительной поверхности Ig выражение проточной цитометрии на активированных В-клеток. В то время как измерение IgA и IgG подклассов проста, измерение IgE с помощью этого метода является проблематичным в связи с растворимыми IgE связывания с FcεRII / CD23 экспрессируется на поверхности активированных В-клеток. Здесь мы опишем уникальная процедура для точного измерения IgE-продуцирующих мыши В-клетки, которые прошли КСО в культуре. Метод основан на трипсина-опосредованного расщеплени IgE-CD23 комплексов на поверхности клеток, что обеспечивает обнаружение IgE-продуцирующих В клональные клеток путем CYtoplasmic окрашивание. Эта процедура предлагает удобное решение для проточной цитометрии анализа КСО IgE.

Introduction

Во время тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) у мышей и людей, IgH μ постоянные экзоны область (cz М) удаляются и заменяются одним из нескольких наборов вниз по течению постоянных экзонов области (C H) (например Cγ, с £ и Са), в результате чего переход от производства IgM к производству других классов Ig (например, IgG, IgE, IgA или). КСО происходит в течение переключатель (S) регионов, которые 1-10 кб последовательности, расположенные 5 'к каждому набору C H S 1. Вызванные активацией цитидиндеаминаза (AID) фермент инициирует КСО с помощью цитидиновое дезаминирования деятельности.

IgE является ключевым медиатором аллергических заболеваний 2 и более глубокое понимание того, как IgE производится и регулируется может открыть двери для новых терапевтических подходов к атопическим заболеванием. У мышей и человека, IgE является наиболее жестко регулируется Ig изотипа. IgE, как правило, обнаруживается на уровнях тысяч ТимаES меньше, чем другие изотипы IgH 3, но может быть значительно выше у болезненных состояний 4. Тем не менее, КСО IgE не полностью поняты. В пробирке активации В-клеток с помощью IL-4 в комбинации с любой анти-CD40 или LPS индуцирует КСО как IgG1 и IgE 5. Активированные В-клетки выразить низким сродством IgE рецептор FcεRII / CD23 2,6, который связывает растворимый IgE, секретируемый в культуре после КСО. Поэтому при анализе с проточной цитометрии, В-клетки с рецептором IgE связаны пятна аналогично B клетки, эндогенно экспрессирующих IgE 7. Хотя известно, что мыши B-клетки экспрессируют низкое сродство рецептора IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, в нашем опыте это не по всей видимости, мешает измерению класса переключение на IgG1. Тем не менее, при измерении переключение IgE после активации В-клеток в культуре, неспецифический поверхностно-св занный IgE может скрывать анализ. С общими методами окрашивания, не-IgE-экспрессирующие клетки окрашиваются положительно для IgE.

Изложенные здесь стратегия, которая была использована для проведения КСО анализов и выявления истинных IgE-выражения В-клеток у мышей, 9 – 11. Лечение активированных В-клеток с трипсином, общий лаборатории реагент, чтобы переварить белок, устраняет как cytophylic и мембраной поверхность IgE. После пермеабилизации и окрашивание цитоплазмы IgE, таким образом, показывает истинное IgE-продуцирующих клеток.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, описанные здесь, были в соответствии с институциональными Комитет Уход за животными и использование (IACUC) руководящие принципы и одобрен Animal Research детской больницы (арку), Бостон, штат Массачусетс. 1. Подготовка реагентов 1,000x ИЛ-4 на складе: Развести…

Representative Results

Эта процедура была успешно реализована для изучения КСО IgE у мышей В-клеток. Чтобы продемонстрировать эффективность при измерении CSR, мы стимулировали мыши В-клетки селезенки с анти-CD40 и IL-4, как описано выше 11. Через пять дней после стимуляции, клетки были собраны и обработаны с исп…

Discussion

Стимуляция мыши селезенки В-клеток в культуре с анти-CD40 и IL-4 будет имитировать Т-хелперов 2-го типа (T H 2) взаимодействие, поощрение переключение класса для IgG1 и IgE 5. В-клетки могут быть активированы для КСО в контексте общего спленоцитов 12 или в очищенных В-клеток селезен…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DRW поддерживается за счет грантов НИЗ AI089972 и AI113217, а также слизистой оболочки иммунологии исследований группы, и имеет награду карьеры для ученых-медиков из Wellcome Фонда Burroughs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse IgE FITC BD Pharmingen 553415 clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE BD Pharmingen 550083 clone A85-1
Methanol BDH BDH1135-4LP Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon Corning 352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon Corning 352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-4052-82 clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40 eBioscience 16-0402-85 clone HM40-3
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
HEPES (1M) Gibco 15630-080
MEM-NEAA (100X) Gibco 11140-050
Phosphate Buffered Saline (10X) Lifetechnologies (Corning) 46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads  Miltenyi Biotec 130-049-501
MACS purification column Miltenyi Biotec 130-042-401
IL-4 PeproTech 214-14 Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10X) Sigma Aldrich T4174-100mL 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)
L-Glutamine 200mM Sigma Aldrich G7513
2-mercaptoethanol (99%) Sigma Aldrich M6250-100mL
Red cell lysis buffer Sigma Aldrich R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 SouthernBiotech 1140-17 clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum Thermo SH30910.03
B cell Stimulation media B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,  1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL)

References

  1. Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
  2. Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
  3. Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
  4. Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
  5. Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
  6. Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
  8. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
  9. Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
  10. Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
  11. Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
  12. Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
  13. Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
  14. Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
  15. Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
  16. Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
  17. Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
  18. Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
  19. Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
  20. Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
  21. He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
  22. Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).

Play Video

Cite This Article
Gallagher, M. P., Shrestha, A., Magee, J. M., Wesemann, D. R. Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells. J. Vis. Exp. (94), e52264, doi:10.3791/52264 (2014).

View Video