Upptäckt av True IgE-uttryck Mus B-celler
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B-lymfocyter immunglobulin tung kedja (IgH-) klassbytesrekombination (CSR) är en process där en början uttryckte IgM växlar till andra IgH isotyper, såsom IgA, IgE och IgG. Mätning av IgH CSR in vitro är en viktig metod för att studera ett antal biologiska processer, från DNA-rekombination och reparation till aspekter av molekylär och cellulär immunologi. In vitro CSR-analys involverar flödescytometrisk mätytan Ig uttryck på aktiverade B-celler. Medan mätning av IgA- och IgG-subklasser är okomplicerad, är mätningar av IgE med denna metod problematisk på grund av löslig IgE-bindning till FceRII / CD23 uttrycks på ytan av aktiverade B-celler. Här beskriver vi en unik procedur för noggrann mätning av IgE-producerande mus B-celler som har genomgått CSR i kultur. Metoden är baserad på trypsin-medierad klyvning av IgE-CD23-komplexen på cellytor, vilket möjliggör detektion av IgE-producerande B-celler genom cytoplasmic färgning. Detta förfarande erbjuder en bekväm lösning för flödescytometrisk analys av CSR till IgE.
Introduction
Under immunglobulin tung kedja (IgH-) klassbytesrekombination (CSR) i möss och människor, μ IgH konstant regionexoner (Cμ) utgår och ersätts med en av flera uppsättningar nedströms konstant regionexoner (C H s) (t.ex. Cy, Ce och Ca), vilket resulterar i en övergång från produktion av IgM till produktion av andra Ig klasser (t.ex. IgG, IgE, eller IgA). CSR sker inom omkopplare (S) regioner som 1-10 kb sekvenser belägna 5 'till varje uppsättning av C H s 1. Aktiverings-Induced cytidindeaminas (AID) enzym initierar CSR via cytidin deaminering aktivitet.
IgE är en viktig förmedlare av allergisk sjukdom 2 och en större förståelse för hur IgE produceras och regleras kan öppna dörrar till nya terapeutiska strategier mot atopisk sjukdom. Hos möss och människor, är IgE den mest hårt reglerad Ig isotyp. IgE normalt upptäcks vid nivåer tusentals times mindre än andra IgH isotyper 3, men kan vara mycket förhöjda i sjukdomstillstånd 4. Emellertid CSR till IgE är ofullständigt känd. In vitro-aktivering av B-celler med användning av IL-4 i kombination med antingen anti-CD40 eller LPS, inducerar CSR både IgG1 och IgE 5. Aktiverade B-celler uttrycker låg affinitet IgE-receptorn FcsRII / CD23 2,6, som binder lösligt IgE utsöndras i kultur efter CSR. Därför när man analyserar med flödescytometri, B-celler med receptorbundet IgE fläck på liknande till B-celler endogent uttrycker IgE 7. Även om det är känt att musen B-celler uttrycker låg affinitet IgG-receptor FcγRIIB1 (CD32) 8, i vår erfarenhet det verkar inte störa mätningen av klassväxling till IgG1. Men när man mäter IgE växling efter B-cellsaktivering i kultur, kan ospecifika ytbundet IgE skymma analysen. Med vanliga färgningsmetoder, icke-IgE-uttryckande celler färgas positivt för IgE.
Skiss här är en strategi som har använts för att genomföra CSR-analyser och upptäcka verkliga IgE-uttryck B-celler från möss 9-11. Behandling av aktiverade B-celler med trypsin, till en gemensam labb reagens smälta protein, avlägsnar både cytophylic och membranbundna yta IgE. Efterföljande permeabilisering och färgning för cytoplasma IgE avslöjar därmed de verkliga IgE-producerande celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stimulering av mus mjält-B-celler i odling med anti-CD40 och IL-4 kommer att simulera T-hjälpar typ 2 (T H2) interaktioner, uppmuntrande klass-switchning till IgG1 och IgE 5. B-celler kan aktiveras för CSR i samband med total splenocyter 12 eller så renade mjälte B-celler 11. Som påpekas i protokollet (steg 2.3), är B-cell anrikning tillval, och är efter bedömning av försöksledaren att bestämma om det skulle fördelaktigt. Positiv magnetisk separation av B-celler s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW stöds av NIH bidrag AI089972 och AI113217, och av Mucosal Immunologi Studies Team, och har en karriär Award för Medicinska Forskare från Burroughs Wellcome fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. . Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -. S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
