진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

요약

B 세포 표면의 Fc 수용체에 결합된 세포구성 IgE 분자로 인해 마우스의 클래스 스위치 재조합에 대한 체외 분석은 어렵습니다. 세포질 형광 염색을 위한 고정 및 투과화 전에 표면 결합 IgE의 트립신 매개 절단을 사용하여 IgE를 검출하는 방법을 설명합니다.

초록

B 림프구 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR)은 처음에 IgM 항체 등의 IgA, IgE 항체와 IgG의 다른 고등학교의 이소 타입으로 전환 표현 된 것을 특징으로하는 과정이다. 시험 관내 IGH CSR의 측정은 분자 세포 면역학의 측면 DNA 재조합 및 수리에 이르기까지 생물학적 공정 수의 연구를위한 중요한 방법이다. 관내 CSR 분석은 활성화 된 B 세포에 대한 유세포 측정면 IG 표현식을 수반한다. 의 IgA와 IgG의 서브 클래스의 측정이 간단하지만,이 방법으로 IgE 항체의 측정으로 인해 용해 IgE 항체가 FcεRII에 결합에 문제가있다 / CD23 활성화 B 세포의 표면에 발현. 여기에서 우리는 문화에 CSR을받은 마우스 B 세포를 IgE 항체가 생산의 정확한 측정을위한 고유 한 절차를 설명합니다. 방법 B에 의해 CY 계통 세포의 IgE가 생산의 검출을 허용 세포 표면에 대한 IgE CD23 복합체 트립신 - 매개 절단에 기초toplasmic 염색. 이 절차에 대한 IgE의 CSR 유세포 분석을위한 편리한 해결책을 제공한다.

서론

마우스와 인간 면역 글로불린 중쇄 (IGH) 클래스 스위치 재조합 (CSR) 중, 고등학교의는 일정한 지역 엑손 (Cμ가) 삭제 및 다운 스트림 일정한 지역 엑손의 여러 세트 중 하나 (C의 _{H s의)} (예를 들어 Cγ로 대체 μ IG 다른 클래스 (예를 들면 IgG를, IgE 항체, 또는 적 IgA)의 제조에 대한 IgM 항체의 생산에서 발생 Cε 스위치 및 Cα). CSR은 C _H의 ^1의 각 세트 5 '위치 1-10킬로바이트 시퀀스는 스위치 (S) 지역 내에서 발생합니다. 활성화 - 유도 시티 딘 데 아미나 제 (AID) 효소는 시티 딘의 탈 아미노 활동을 통해 CSR을 시작합니다.

IgE 항체는 알레르기 질환 ^2의 주요 중재자 및 IgE의 생산 및 아토피 질환에 대한 새로운 치료 방법으로 문을 열 수 있습니다 규제 방법에 대한 이해이다. 마우스와 인간에서의 IgE는 가장 엄격하게 규제 IG 이소 타입이다. IgE 항체는 일반적으로 팀의 수준 수천에서 감지ES 다른 IGH 미만 ³ 아이소 타입이지만 높은 질환 상태 ^4에서 증가 될 수있다. 그러나 IgE 항체에 CS....

프로토콜

참고 : 여기에 설명 된 모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라했고, 동물 연구 아동 병원 (ARCH), 보스턴, 질량에 의해 승인했다.

시약 1. 준비

1. 1000 배 스톡 IL-4 : H ₂ O 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 20 μg의 / ㎖ 묽은 IL-4 사이토 카인. -20 ℃에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 및 상점을 200㎕ 분량 씩 분주한다.
2. 1,000 배 안티 CD40 : 4 ℃에서 1.0 ㎎ / ㎖, 가게에서 제조 업체에서 얻습니다.
3. B 세포 자극 미디어 : RPMI-1640 배지 425 mL의 추가, 75 갓 해동 소 태아 혈청의 ㎖ (FCS), 1.0 M HEPES 버퍼, 5 ML의 L 글루타민 재고 10 ㎖, 5 ml의 페니실린 : 스트렙토 마이신 주식, 5 2- 머 캅토 에탄올 ml의 최소 필수 중간 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA), 3.5 μL. 일주일에 최대 4 ℃에서 둡니다. IL-4 (20 NG / ㎖) 및 항 CD40 (1.0 ㎍ / ㎖)에 사용 직전에 추가단지 필요한 미디어의 볼륨.
4. 2 % FCS-FACS 버퍼 : 1X PBS의 490 ml의 FCS의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 보관....

결과

이 절차가 성공적으로 마우스 B 세포에서 IgE 항체에 CSR을 연구하기 위해 구현되었습니다. 앞서 설명한 바와 같이 ¹¹ CSR 측정에서 효율을 입증하기 위해, 우리는 항 CD40 및 IL-4와 마우스 비장 B 세포를 자극. 자극 5 일 후, 세포를 수거하고, 프로토콜 형광 표지 IgM이, IgG1에, IgE 항체, 및 B220 (CD45R) 항체 상술과 염색을 이용하여 처리 하였다. (도 1), + 세포의 IgE에 명확한 인구 깔끔하게 트립신 처리 (도 2a)없이 판별 될 수 블라스팅 림프구 게이트. 그러나, 고정 및 투과성으로 이전에 세포의 트립신으로 인해 표면 바인딩 IgE 항체의 제거에 IgE 항체 생산 세포 (그림 2b)의 분리를 할 수 있습니다.

토론

항 CD40 및 IL-4와 문화에 마우스 비장 B 세포의 자극의 IgG1과 IgE의 ⁵ T 도우미 2 형 (T _H 2) 상호 작용을 격려 클래스 전환을 시뮬레이션합니다. B 세포는 비장 세포 총 ¹² 또는 정제 된 비장의 B 세포 ^(11)의 맥락에서 CSR을 위해 활성화 될 수있다. 프로토콜 (단계 2.3)에서 설명한 바와 같이, B 세포 농축은 선택 사항이며, 그것은 유익 할 것이다 있는지 확인 실험자의 판단이다. CD45R (B220)를 사용하여 B 세포의 양성 자성 비드 분리가 여기에 사용된다 -labeled. 분리 후, B 세포 농도를 적절한 항체 및 사이토킨 자극에 1.0 × ¹⁰⁶ 세포 / ml로 조절 될 수 있도록하여 FACS 세포 순도를 확인할 것을 권장한다. 또한이 냉동 / 해동 사이클을 거쳤다 IL-4 단백질 활성을 감소 수도 있음에 유의해야한다.

이전의 고정 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티 마우스 IgE FITC	BD Pharmingen 553415		클론 R35-72
쥐 안티 마우스 IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	클론 A85-1
메탄올	BDH	BDH1135-4LP	-20 °에서 유지; C
팔콘 셀 스트레이너 40 &마이크로; m 나일론	Corning	352340
팔콘 셀 스트레이너 70 &마이크로; m 나일론	Corning	352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	클론 RA3-6B2
안티 마우스/쥐 CD40	eBioscience	16-0402-85	클론 HM40-3
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
인산염 완충 식염수 (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) 마이크로비즈	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS 정제 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	물 또는 0.1% BSA
포르말린 용액, 중성 완충, 10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
트립신-EDTA 용액(10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5.0 g 트립신, 2.0 g EDTA• 0.9% NaCl
페니실린-스트렙토마이신	시그마 알드리치	P0781-100 ml	10,000 U 페니실린; 10 mg/ml 스트렙토마이신(100x
)L-글루타민 200 mM	시그마 알드리치	G7513
2-메르캅토에탄올(99%)	시그마 알드리치	M6250-100 ml
적혈구 용해 완충액	시그마 알드리치	R7757
쥐 안티 마우스 IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	클론 1B4B1
HyClone 태아 송아지 혈청	Thermo	SH30910.03
B 세포 자극 매체			B 세포 자극 매체는 RPMI와 태아 송아지 혈청 (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-글루타민,  1x 페니실린-스트렙토마이신 (페니실린: 100 U/ml, 스트렙토마이신: 100 &마이크로; g/ml), 베타-메르캅토에탄올(7 µ L/L), IL-4 (20 ng/ml) 및 anti-CD40 (1 µ g/ml)

리터당 4Na