The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
प्रोटीन संश्लेषण के नियमन के तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण नियंत्रण बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है. विशेष रूप से, विचारशील आरएनए नियामक तत्व आम तौर पर एक विशेष तनाव की प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक प्रोटीन के लिए सांकेतिक शब्दों में जो विशिष्ट mRNAs, के चुनिंदा अनुवाद करने के लिए अनुमति देने के लिए दिखाया गया है. इन mRNAs, साथ ही चयनात्मक अनुवाद के लिए जिम्मेदार नियामक तंत्र के लक्षण वर्णन की पहचान कुछ समय के लिए आणविक जीव विज्ञान के मामले में सबसे आगे रहा है. Polysome रूपरेखा इन अध्ययनों में एक आधारशिला विधि है. polysome रूपरेखा का लक्ष्य अलग टेप पर सक्रिय रूप से अनुवाद करने राइबोसोम immobilizing द्वारा mRNA के अनुवाद पर कब्जा है और इस प्रकार अत्यधिक अनुवादित टेप और खराब अनुवादित लोगों के बीच एक भेद की अनुमति के लिए एक sucrose के ढाल पर ultracentrifugation द्वारा परिणामस्वरूप polyribosomes अलग करने के लिए है. ये तो आगे परंपरागत जैव रासायनिक और आणविक जीवविज्ञान के तरीकों के द्वारा होती जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, के संयोजन पीउच्च throughput जीनोमिक दृष्टिकोण के साथ olysome रूपरेखा translational विनियमन के एक बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.
प्रोटीन संश्लेषण (अनुवाद) का नियमन अच्छी सेलुलर अस्तित्व से जुड़ा हुआ है जो एक प्रमुख सेलुलर प्रक्रिया है. अनुवाद सेल की ऊर्जा का 50% से अधिक की खपत को देखते हुए यह अनुवाद कसकर नियंत्रित किया जाता है कि और अनुवाद में perturbations अच्छी तरह सहन नहीं कर रहे हैं कि आश्चर्य की बात नहीं है. इसके विपरीत, कई न्यायपालिका सेलुलर प्रक्रियाओं अनुवाद मशीनरी और अनुवाद निर्गम (यानी proteome) संशोधित करने की आवश्यकता है कि. इस बार विभिन्न तनाव प्रतिक्रिया और बीमारी राज्यों में ऐसा ही मामला है, और शायद सबसे अच्छा कैंसर में उदाहरण है. Translational नियंत्रण की एक प्रमुख लाभ तेजी से विभिन्न बाहरी और आंतरिक चलाता है के जवाब में प्रोटीन उत्पादन reprogram करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता है, जिससे ठीक ट्यूनिंग तंत्र है कि सुझावों सेल अस्तित्व और मृत्यु 1 के बीच संतुलन.
Translational नियंत्रण के दो पहलुओं विशेष रूप से दिलचस्प हैं; नियामक MEC की प्रकृति की समझपहली जगह में चयनात्मक अनुवाद हासिल है कि विशेष ट्रिगर करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में भाग लेने कि hanism (एस) और नियंत्रण विशिष्ट अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं कि तत्वों, और विशिष्ट mRNAs का पहचान और उनके प्रोटीन उत्पादों. Polysome रूपरेखा दोनों प्रक्रियाओं के प्रभावी अध्ययन की अनुमति देता है कि एक तकनीक है.
polysome रूपरेखा तकनीक के समग्र लक्ष्य का अध्ययन और विभिन्न सेलुलर शर्तों के तहत विशिष्ट mRNAs का अनुवाद राज्य यों है. तकनीक का सिद्धांत इस प्रकार, एक sucrose के ढाल पर ultracentrifugation द्वारा परिणामस्वरूप polyribosomes '' ठंड 'अलग टेप पर सक्रिय रूप से अनुवाद करने राइबोसोम और अलग' (कई राइबोसोम से बंधे) अत्यधिक अनुवादित टेप के बीच एक अंतर के लिए अनुमति देकर mRNA के अनुवाद पर कब्जा करने के लिए है खराब (एक या दो राइबोसोम से बंधे) लोगों अनुवादित. इस विशेष प्रोटोकॉल में, एंटीबायोटिक cycloheximide को बांधता है कि60 ribosomal सबयूनिट और ब्लॉक राइबोसोम ई साइट 2 से deacetylated tRNA की रिहाई, राइबोसोम स्थानान्तरण रोकना और अनुवाद के mRNAs पर राइबोसोम स्टाल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, यह भी ब्लॉक अनुवाद बढ़ाव 3, इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह के इमेटिन के रूप में अन्य अवरुद्ध एजेंटों.
पश्चिमी सोख्ता और अनुवाद प्रक्रिया के अंतिम उत्पादन को मापने कि 35 एस Methionine लेबलिंग तकनीक के विपरीत, इस प्रकार विभिन्न परिस्थितियों में अनुवाद तंत्र की एक अधिक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है, रूपरेखा सक्रिय रूप-अनुवादित mRNAs साथ राइबोसोम एसोसिएशन मापने का लाभ दिया polysome. इसलिए, तकनीक आसानी से विशेष रूप से अनुवाद 4-6 के विभिन्न तरीकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, प्रोटीन कारकों अनुवाद विनियमन 7-9, प्रोटीन संश्लेषण 1,10,11 या इस तरह के अपस्ट्रीम IRES या के रूप में mRNA के संरचनाओं के प्रभाव को प्रभावित तनाव की स्थिति में शामिल प्रोटीन synth पर खुला पढ़ने फ्रेमesis 12-14. आजकल, polysome रूपरेखा आवेदनों भी व्यापक polysomes जुड़े mRNAs का विश्लेषण करने के लिए डीएनए 15 या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 16,17 के उपयोग के साथ कर रहे हैं.
Polysomal रूपरेखा अलग उपचार शर्तों के तहत विशिष्ट टेप के अनुवाद की राज्य की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है. यह सिद्धांत रूप में एक बहुत ही सरल तकनीक है फिर भी यह अच्छा polysome प्रोफाइल के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं, जिनमें से कुछ निष्पादन के कई चरणों की आवश्यकता है. 1) RNase मुक्त रसायन और plasticware का उपयोग, 2) (अच्छा सूक्रोज ढ़ाल तैयारी हमारे अनुभव में एक 10-50% sucrose के ढ़ाल कुशलतापूर्वक बाध्य राइबोसोम के साथ 40/60 सब यूनिटों और mRNAs) को हल करने के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं, और 3: इन महत्वपूर्ण कदम हैं ) अनुवाद की दर सबसे अधिक कब्जा करने के क्रम में तेजी से बढ़ रहे हैं कि कोशिकाओं और कोई 80% से अधिक मिला हुआ इस्तेमाल करते हैं. इस तरह के जीन पछाड़ना या overexpression के रूप में लंबे समय सेल उपचार कर जब थाली करने के लिए कोशिकाओं की राशि कोशिकाओं समापन बिंदु पर मिला हुआ हो जाएगा कितना के एक समारोह होगा कि इतना यह बाद कदम, को ध्यान में रखा जाना चाहिए.
परिणामों में presenटेड यहाँ, polysome प्रोफाइल विश्लेषण IRES-शरण mRNAs XIAP और बीसीएल-एक्सएल 12 का अनुवाद विनियमन में PDCD4 भूमिका का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण था. हम PDCD4 तोड़े नीचे (चित्रा 1 बी) पर सामान्य polysome प्रोफाइल में कोई भी परिवर्तन का पालन नहीं किया तथ्य यह है कि हमें PDCD4 प्रयोग की शर्तों के तहत वैश्विक सेलुलर अनुवाद ख़राब नहीं था कि समाप्त करने के लिए अनुमति दी. हम अगले PDCD4 या नियंत्रण siRNAs के साथ इलाज किया कोशिकाओं में XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNAs का वितरण निर्धारित करने के लिए आर टी-qPCR विश्लेषण का इस्तेमाल किया. यह mRNA के वितरण का एक मात्रात्मक बजाय अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए और उपचार के बीच translational दक्षता में सूक्ष्म बदलाव का पता लगाने के लिए अनुमति देता है क्योंकि qPCR, मानक आरटी-पीसीआर या उत्तरी सोख्ता के लिए विरोध के रूप में, polysome प्रोफाइल विश्लेषण करने के लिए विकल्प की एक विधि है. इस तकनीक का उपयोग करना, हम XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNAs का वितरण (जीआर भर में कुल लक्ष्य mRNA की एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कि दिखाने के लिए सक्षम थेadient) काफी इस प्रकार इन mRNAs का अनुवाद में वृद्धि का संकेत है, PDCD4 तोड़े नीचे (चित्रा -1, ई) के बाद उनके साथ जुड़े राइबोसोम की एक बड़ी संख्या) के साथ भारी polyribosomes (mRNAs में स्थानांतरित कर दिया गया था. यह आगे XIAP और बीसीएल-एक्सएल प्रोटीन के स्तर में नहीं बल्कि उनके स्थिर राज्य आरएनए स्तर (चित्रा 1F, जी) में वृद्धि के द्वारा पुष्टि की गई. महत्वपूर्ण बात है, XIAP की गैर IRES संस्करण की polysome वितरण और इलाज कोशिकाओं (चित्रा 1C) के बीच अपरिवर्तित रहा था. वैकल्पिक रूप से, translational दक्षता 14 (आमतौर पर 2 से 4 भिन्न) monosomes बनाम polysomes में mRNA सामग्री के अनुपात (आमतौर पर 5 से 10 भिन्न) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है.
254 एनएम पर absorbance रीडिंग से मनाया चोटियों अपने दम पर ribosomal शाही सेना (डिटर्जेंट के लिए जिम्मेदार ठहराया नहीं जा सकता है के रूप में प्रोटोकॉल के दौरान नियंत्रण का उपयोग, परिणाम रूपरेखा किसी polysome मान्य में महत्वपूर्ण हैऐसे ट्राइटन X-100 के रूप में है, दृढ़ता से) स्पेक्ट्रम के इस क्षेत्र में अवशोषित और ढाल के शीर्ष पर 40/60 चोटियों अस्पष्ट हो सकता है. Lysate बिना और / या lysate बफर के साथ खाली ढ़ाल 254 एनएम पर absorbance के लिए बफ़र्स के रिश्तेदार योगदान निर्धारित करने के लिए चलाने की जरूरत है. Artefactual उच्च आदेश संरचनाओं भी तथ्य कोई नहीं में (उदाहरण के लिए "छद्म polysomes" 20) हैं जहां polysomes की गलत व्याख्याओं को जन्म दे सकता है. मैग्नीशियम sequestering द्विसंयोजक कटियन chelator EDTA के साथ (80 के दशक राइबोसोम को स्थिर करने के लिए प्रक्रिया के दौरान प्रयुक्त) बड़े (60 अपने घटक छोटे (40s) में राइबोसोम की जुदाई का कारण है और होगा lysates करने और ढाल बफर (15 मिनट के लिए 20 मिमी) में जोड़ा ) सब यूनिटों. 260 एनएम पर दर्ज absorbance के चोटियों polysomes वास्तव में कर रहे हैं इस प्रकार, यदि EDTA के इलाज के लिए एक भी अधिकतम mRNA और राइबोसोमल इकाइयों को मुक्त करने के लिए संगत ढाल के शीर्ष के पास मनाया जाएगा कि इस तरह के प्रोफाइल गिर जाएगा (नहीं दिखाया डेटा). मुनासिबप्रोफ़ाइल के EDTA प्रेरित पतन के साथ, qPCR द्वारा विश्लेषण विशिष्ट लक्ष्य के सभी अब ढाल के शीर्ष पर पाया जाना चाहिए.
एक mRNA के साथ जुड़े राइबोसोम की संख्या हमेशा विशेष mRNA के अनुवाद किया जा रहा है कि कैसे कुशलता का सूचक नहीं है. दरअसल, polysomes पर सक्रिय अनुवाद पाठक के बारे में पता होना चाहिए जो 21,22 ठप हो जाता है जिसमें विशिष्ट संदर्भों रहे हैं. टेप सक्रिय रूप EDTA के विपरीत, 'रन दूर' सक्रिय रूप से एक mRNA के पार translocating रहे हैं कि राइबोसोम के कारण बनता है जो puromycin साथ नमूना, इलाज) एक करके किया जा सकता अनुवाद मशीनरी के साथ लगे हुए हैं, या बी) नमूना इलाज कर रहे हैं या नहीं, निर्धारण फिर किसी भी नीचे की ओर translocating राइबोसोम की 'रन-बंद' के कारण, शुरू कोडोन पर केवल पहले राइबोसोम के स्थानान्तरण को रोकता है जो homoharringtonine साथ.
qPCR के विश्लेषण के लिए नियंत्रण टेप का उपयोग भी महत्वपूर्ण है. selecऐसे XIAP IRES की गैर IRES संस्करण कुछ गृह व्यवस्था जीन (GAPDH, actin, ट्यूबिलिन, Nucleolin), राइबोसोमल mRNAs (18S, RPL13A) के रूप में या इस मामले में अलग-अलग उपचार स्थितियों से प्रभावित नहीं हैं कि टेप के लिए tion, में महत्वपूर्ण है पुष्टि करने के अनुवाद पर उपचार के प्रभाव विशिष्ट या सामान्यीकरण है. ये नियंत्रण टेप यहाँ किया गया था के रूप में विश्लेषण mRNAs का वितरण मानक के अनुसार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (XIAP और बीसीएल-एक्सएल mRNAs GAPDH mRNA के लिए सामान्यीकृत और हर अंश में mRNA सामग्री की राशि के प्रतिनिधित्व वाले कुल mRNA के सामग्री का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया ) या वैकल्पिक रूप से, लक्ष्य और नियंत्रण mRNAs निरपेक्ष मूल्यों के रूप में व्यक्त किया है और अलग से दिखाया जा सकता है. इनपुट lysates (कुल मात्रा का आमतौर पर 10%) की qPCR विश्लेषण विशिष्ट mRNAs का वितरण के लिए नियंत्रण होगा कि एक और कदम है. आदर्श रूप में, इनपुट lysate में एक विशिष्ट प्रतिलेख के mRNA के सामग्री का विश्लेषण किया सभी 10 भागों में mRNA के सामग्री की राशि के बराबर हो जाना चाहिए. अंत मेंएक वैकल्पिक कदम फिनोल के लिए नियंत्रित करने के लिए: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण कदम (कैट, chloramphenicol एसिटाइल ट्रांस्फ़्रेज़ जैसे) बाद में qPCR द्वारा मात्रा निर्धारित किया जाएगा और भी इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानक के अनुसार इन विट्रो लिखित संवाददाता mRNA के साथ प्रत्येक polysome अंश स्पाइक है डेटा 14.
किसी भी तकनीक के साथ के रूप में, polysome रूपरेखा कुछ सीमाएं प्रस्तुत करता है. आमतौर पर 10 भिन्न की एक न्यूनतम अच्छा polysome वितरण के क्रम में एकत्र होने की जरूरत (अनुवाद दक्षता में और अधिक सूक्ष्म बदलाव 20 या अधिक आवश्यकता हो सकती है) इस तथ्य है कि इस कदम के 4 नमूने का केवल एक अधिकतम हो सकता है कि भावना में, सीमित बनाता है एक समय पर विश्लेषण किया आराम से एक ही बार में शाही सेना निष्कर्षण और 40 नमूने और 4 इनपुट नियंत्रण की qPCR विश्लेषण संभाल करने में सक्षम हो. नमूना आकार आसानी qPCR के पास करने के लिए प्रतिकृति कितने टेप का विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं और कितने के साथ जोड़ सकते हैं, और यह महंगा हो सकता है. एक qPCR आधारित polysomal रूपरेखा एक की एक और सीमाnalysis यह केवल (टेप पहले से जाना जाता विश्लेषण किया है) और अनुवाद के जीनोम चौड़ा विश्लेषण के लिए लागू नहीं किया जा सकता है एक उम्मीदवार-आधारित दृष्टिकोण पर किया जा सकता है. हालांकि, 21 वीं सदी की शुरुआत में, जांचकर्ताओं डीएनए का उपयोग कर एक जीनोमिक स्तर पर उनके polysomal शाही सेना से पूछताछ करने के लिए शुरू अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 16,17 से अधिक हाल ही में 15 और प्रोटीन. बल्कि व्यक्तिगत अंशों की qPCR विश्लेषण प्रदर्शन से सिवाय इसके कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में इस शक्तिशाली दृष्टिकोण में, polysomal रूपरेखा किया जाता है, वैश्विक अनुवाद में भिन्न (आमतौर अंश 2-4) और polysomes भिन्न (आमतौर पर भिन्न) एक साथ जमा कर रहे हैं और विविधताओं विश्लेषण monosomes डीएनए माइक्रोएरे या पूरे जीनोम शाही सेना अनुक्रमण द्वारा. इसलिए इस दृष्टिकोण के साथ, यह आकलन करना संभव है सभी जिसका वितरण बदलाव polysomes से monosomes के लिए (अनुवाद में कमी) या उपाध्यक्ष प्रतिकूल (अनुवाद में वृद्धि) एक विशिष्ट इलाज पर mRNAsबयान. विशिष्ट mRNA के polysomes वितरण के प्रमाणीकरण और मात्रा का ठहराव तो qPCR के द्वारा किया जा सकता है. Polysomal रूपरेखा सिद्धांत का एक और भी अधिक शक्तिशाली उपयोग राइबोसोम की रूपरेखा है. इस तकनीक के आगे उच्च throughput विस्तार polysome भिन्न 23 के सैकड़ों की एक साथ निगरानी के लिए अनुमति देता है कि हाल ही में सूचना मिली थी. उत्परिवर्ती संग्रह की या एक बड़े पैमाने पर आरएनएआई स्क्रीन में translational क्षमता की जांच कर रही है जब यह एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है. राइबोसोम की रूपरेखा प्रोटीन संश्लेषण 24,25 में लगे हुए राइबोसोम (राइबोसोम पैरों के निशान) द्वारा संरक्षित शाही सेना के टुकड़े नक्शा करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का लाभ लेता है कि एक तकनीक है. इस तकनीक में, राइबोसोम स्थानान्तरण cycloheximide (प्रतिवर्ती) या इमेटिन (अपरिवर्तनीय) राइबोसोम पैरों के निशान की आबादी उपज के लिए सेल और RNase पाचन द्वारा पीछा साथ हिचकते जा सकता है. राइबोसोम, समृद्ध कुल शाही सेना अलग है, और contaminating राइबोसोमल और mitochondrial ribosomal शाही सेना हटा दिया जाता है.लगभग 26-28 न्यूक्लियोटाइड की शाही सेना पैरों के निशान अलग होते हैं, एक सीडीएनए पुस्तकालय में परिवर्तित, लिखित और 26 अनुक्रम रिवर्स. मानक polysome रूपरेखा के विपरीत, इस दृष्टिकोण से न केवल translationally विनियमित रहे हैं कि विशिष्ट mRNAs को पहचानती है लेकिन यह भी एक विशिष्ट प्रतिलेख साथ सटीक व्यवसाय और राइबोसोम के घनत्व के रूप में कोडोन प्रस्ताव पर mRNA के-विशिष्ट जानकारी पैदावार. यह हो रहा है, जहां प्रतिलिपि राइबोसोम-भर्ती पर पर अधिक जानकारी दे सकता है, क्योंकि यह विशेष रूप से इस तरह के IRES-शरण mRNAs के रूप में अनुवाद के विशेष मोड के साथ mRNAs के लिए ब्याज की है.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |