Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen
Summary
Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.
Abstract
De studie van eiwit interacties in de context van levende cellen kritische informatie over lokalisatie, dynamiek en interactie partners genereren. Deze informatie is bijzonder waardevol in de context van gastheer-pathogeen interacties. Veel pathogenen eiwitten functioneren in gastheercellen verschillende wijze zoals mogelijk vermijden dat het gastheerimmuunsysteem en overleving binnen het intracellulaire omgeving. Om deze pathogeen-eiwit gastheer-cel interacties te bestuderen, zijn verschillende benaderingen vaak gebruikt, zoals: in vivo infectie met een stam die een getagde of mutant eiwit, of de introductie van pathogeen genen via transfectie of transductie. Elk van deze benaderingen heeft voordelen en nadelen. We zochten een middel om exogene eiwitten direct invoeren in cellen. Elektroporatie wordt vaak gebruikt om nucleïnezuren in cellen te introduceren, maar is minder vaak toegepast om proteïnen hoewel de biofysische basis is precies hetzelfde.Een standaard electroporator werd gebruikt om de affiniteit gelabelde bacteriële effectoren introduceren in zoogdiercellen. Human epitheliale en muis macrofaagcellen werden gekweekt door de traditionele methoden, vrijstaand, en geplaatst in 0,4 cm kloof elektroporatie cuvetten met een exogene bacterieel pathogeen eiwit van belang (bijvoorbeeld Salmonella Typhimurium GtgE). Na elektroporatie (0,3 kV) en een korte (4 uur) herstelperiode, werd intracellulaire eiwit geverifieerd door fluorescent labelen van het eiwit via zijn affiniteitsmerker en onderzoeken van ruimtelijke en temporele verdeling van confocale microscopie. De geëlektroporeerde eiwit werd ook aangetoond functioneel in de cel en in staat correcte subcellulaire handel en eiwit-eiwit interactie te zijn. Terwijl de exogene eiwitten neiging ophopen op het oppervlak van de cellen, de geëlektroporeerde monsters hadden sterk verhoogde intracellulaire effector concentratie ten opzichte van alleen incubatie. Het protocol is eenvoudig en snel genoeg om te worden gedaan in aparallel mode, waardoor voor high-throughput karakterisering van pathogeen eiwitten in gastheercellen waaronder subcellulaire targeting en functie van virulentie-eiwitten.
Introduction
Vele Gram-negatieve bacteriën gebruiken gespecialiseerde secretie systemen virulentie gerelateerde eiwitten (hierna effectoren) direct te injecteren in gastheercellen 1-5. Deze effectoren hebben een breed scala van biologische functies, waaronder: onderdrukking van de immuniteit van de gastheer, het cytoskelet veranderingen, wijziging van het intracellulair verkeer en signalering, transcriptionele veranderingen, en gastheer proteasoom veranderingen 6-9. De functies van bepaalde effectoren zijn bekend, maar de gastheer doelstellingen en biochemische werking (en) van vele anderen nog worden bepaald. Bij het vergelijken van wild-type en recombinante bacteriële infecties geldige benadering intracellulaire effector virulentiemechanismen bestuderen, is het vaak voordelig om een individuele effector introduceren in de gastheercel. Aldus eenvoudige werkwijzen voor het inbrengen en karakteriseren bacteriële effector eiwitten in het kader van gastheercellen is zeer gewenst.
Vereenvoudiging van de experimentele analyse wiste één effector is kritisch als andere effectoren kunnen tegengestelde of overbodige functies hebben. Om deze vereenvoudiging te bereiken, hebben de onderzoekers eerder geïntroduceerde macromoleculen in cellen door vele verschillende methoden, waaronder virale transductie 10, micro-injectie 11, schraap het laden van 12,13, celfusie met chemisch geïnduceerde micro-injectie 14, merkgebonden eiwit "transfectie" reagentia 15, calciumfosfaat neerslag 16 en elektroporatie 17-20. De ingevoerde moleculen variëren van nucleïnezuren zoals DNA, RNA, en RNAi soorten eiwitten, cellen ondoordringbare kleurstoffen en antilichamen voor intracellulaire doelwitten 21,22. Sommige methoden hebben beperkingen waaronder het type macromolecuul dat kan worden ingevoerd, en inzonderheid downstream analyses kunnen worden beperkt door hoge cellulaire toxiciteit, schadelijke werkingsmechanismen, lage werkzaamheid, of introductie efficiency. Transfectie, een often gebruikte methode voor het tot expressie brengen van bacteriële genen in zoogdiercellen, lijdt ook de beperking dat enkele relevante gastheercel soorten, zoals macrofagen en primaire cellen, bijzonder resistenter voor transfectie. Naast dit, is het moeilijk om de niveaus van bacteriële eiwit geproduceerd bij inbrengen van vreemd DNA controle.
Veel werk elektroporatie van nucleïnezuren in zowel bacteriële en zoogdiercellen als gemeenschappelijk laboratoriumtechniek vastgesteld; echter, er voortdurend onderzoek naar de beste methoden voor het leveren van eiwitten in cellen onder fysiologische omstandigheden. Rapporten over proteïne transfectie zijn veelbelovend, maar vereisen dure reagentia en optimalisatie. De wens mogelijk toxische bacteriële effectoren introduceren in diverse cel targets met minimale kosten leidde ons naar elektroporatie beschouwen als een methode voor het bestuderen van deze eiwitten in vivo.
Eiwit elektroporatie 23-25 is een ontmoetinghod om eiwitten te introduceren in levende cellen via electropermeabilization, ook wel elektro-transfectie of elektro-injectie 26. Deze techniek maakt gebruik van hoge intensiteit elektrische pulsen poriën in celmembranen te maken. Deze omkeerbare poriën laten macromoleculen die normaal gesproken worden uitgesloten van intracellulaire ruimte om de cel in te voeren. Na verwijdering van het externe elektrische veld, kan het membraan opnieuw verzegelt, waardoor de cel moleculen die doorheen de poriën 27,28 behouden.
Een standaard electroporator werd in dit onderzoek om bacteriële effectoren consequent voeren in zowel muizen macrofaag-achtige cellen en humane epitheelcellen. De werkwijze is snel, efficiënt en goedkoop, zonder noemenswaardige daling van cellulaire levensvatbaarheid. De geïntroduceerde eiwitten kunnen worden gevisualiseerd immunofluorescentie microscopie of voor functionele bepalingen. Dit is aangetoond met groen fluorescent proteïne (GFP) als een niet-toxische standaard, entwee Salmonella effector-eiwitten, SspH1 en GtgE. Wij stellen eiwit elektroporatie als een extra instrument in het repertoire voor de studie van bacteriële virulentie eiwitten en hun functies in eukaryote gastheercellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afgescheiden effectoren van pathogene bacteriën geëvolueerd functioneren in de gastheercel worden en daardoor is het nuttig om te bestuderen in situ in de gastheer. Invoering van specifieke effectoren van belang in gastheercellen kan de desbetreffende pathogeen-gastheer interacties worden bestudeerd isolatie zonder interferentie van andere bacteriële eiwitten. Het doel was om elektroporatie staand als middel om bacteriële effector eiwitten te introduceren in eukaryote gastheercellen, waardoor sommige van de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.
Materials
| Material or Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus – Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino … [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan … [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
