A Mouse Fetal Skin Modell av scarless Wound Repair

Summary

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Abstract

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introduction

Foster huden sår leges raskt og scarlessly før sent i svangerskapet ^1. Føtalt scarless reparasjon sår er kjennetegnet ved regenerering av normalt vev arkitektur og funksjon. Overgangen fra en scarless til arrdannelse fenotype oppstår i tredje trimester av svangerskapet hos mennesker og rundt embryonale dag 18 (E18) i mus ^2,3. I forhold til voksen, er føtal reparasjon såret karakterisert ved hurtig epithelialization, bindevev avsetning, og fibroblast migrasjon.

Mange studier har tilbudt mulige forklaringer på fenomenet scarless sårtilheling under tidlig fosterutvikling. Betennelse er en fundamental del av voksen reparasjon såret; imidlertid føtale sår kjennetegnet ved en mangel på akutt inflammasjon ^4. Hvorvidt dette er et resultat av den funksjonelle umodenhet av immunsystemet i løpet av foster faser forblir uklar. En fersk studie antydet at forskjeller i overflod, matteile sikkerhetssitu, og funksjon av mastceller i E15 vs. E18 fosterets hud kan være ansvarlig for overgangen fra en scarless fenotype, i hvert fall i musen ^tre. Andre studier posit at forskjeller i egenskaper og overflod av føtale og voksne makrofager sår er ansvarlig for reformasjon av normal ekstracellulære matrise (ECM) under foster såret reparasjon ^fem.

Forskjeller i miljøfaktorer under utvikling foster og voksne kan også påvirke sår reparasjon. Longaker og medarbeidere viste at såret fluid fra fosteret besitter høye nivåer av hyaluronsyre-stimulerende aktivitet, sammenlignet med ingen i voksen sårvæske ^6. Følgelig kan høyere nivåer av hyaluronsyre, et glykosaminoglykan som fremmer en mikromiljøet bidrar til cellemotilitet og spredning, i foster sårmiljø være ansvarlig for scarless fenotype sett under tidlig fosterutvikling. Andre linjer av bevis peker på det faktum at fetal såret miljø er relativt hypoxemic og nedsenket i sterile fostervann rik på vekstfaktorer ^7. Imidlertid har ingen fasitsvar blitt gitt for en kritisk hendelse eller faktor under embryogenese som utløser overgangen fra scarless regenerering til fibrotisk reparasjon.

Forstå mekanismene ansvarlig for scarless healing hos fosteret nødvendiggjør en presis og reproduserbar modell. Her vi detalj en reproduserbar modell av foster scarless sårtilheling i ryggen E16.5 (scarless) og E18.5 (arrdannelse) museembryoer. I tillegg kan små variasjoner av denne modellen benyttes til å utføre en rekke videre studier, for eksempel analyse av genuttrykk av føtale sår og hud ^8,9. Gitt at nettopp tidsbestemte svangerskap er avgjørende for vellykket gjentagelse av denne foster scarless sårtilheling modell, vi også detalj vår protokoll for superovulering timet svangerskap.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer som er beskrevet i denne artikkelen er utført i henhold til retningslinjer fastsatt av Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC). 1. Tidsbestemt svangerskap – superovulation Teknikk (figur 1) MERK: Nøyaktig timing gestasjonsalder museembryoer for fosterkirurgi ved E16.5 og E18.5 er av avgjørende betydning. I denne delen vi detalj vår protokoll for timing muse svangerskap hjelp gravid hopper serum (PMS) og humant chori…

Representative Results

For histologisk analyse, bør kutane sår i rygghuden av E16.5 og E18.5 mus embryoer høstes 48 timer etter såret, fiksert i 4% PFA, og parafininnleiret. I fluorescerende transgene modeller, kan nedfrysing med oktober være hensiktsmessig. Det er flere flekker som kan anvendes til å visualisere cellulære og bindevev arkitektur. Hematoxylin og eosin er en to-farge flekken som flekker atomkjerner blå og eosinofile strukturer (ie., Cytoplasma og ekstracellulært kollagen) ulike nyanser av rødt, rosa og oransj…

Discussion

Den kirurgiske protokollen presenteres her beskriver en excisional modell av foster murine scarless healing først publisert i 2006 av vårt laboratorium ^10. I tillegg til andre etablerte modeller av excisional såret ^11, operasjonssåret modeller av foster murine scarless healing eksistere så vel ^12,13. Undersøkelser av fosterets scarless sårtilheling i ape, lam, kanin, pungrotte, og rotter har blitt rapportert ^14-17. Men mus representerer en ideell modell for å utforske …

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058